左心辅助装置致心肌梗死早期心肌卸负荷后心肌细胞变化的研究

甘　宇，周建业，胡盛寿，唐　跃，杨新卫，陈海波，闫晓倩，孙嘉康

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院，心血管疾病国家重点实验室



左心辅助装置致心肌梗死早期心肌卸负荷后心肌细胞变化的研究

甘宇1，周建业2，胡盛寿2，唐跃2，杨新卫1，陈海波2，闫晓倩2，孙嘉康2

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院，心血管疾病国家重点实验室

摘要：目的 制作羊急性心肌梗死模型，观察左心辅助装置卸负荷干预下心肌细胞发生的变化，为左心辅助装置能否应用于急性心肌梗死病人提供依据。方法实验组3只成年小尾寒羊在心脏不停跳下植入左心辅助装置(FW-Ⅱ型轴流泵)，另3只为对照组不作卸负荷处理。记录心肌梗死后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h肌钙蛋白I(CTn I)值评价心肌细胞损伤程度。72 h后取出标本，观察心肌细胞破坏及炎症细胞浸润情况，以及检测两组动物心肌细胞凋亡情况。结果卸负荷后各个时间点实验组CTn I值变化幅度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，实验组心肌梗死及梗死边带区域炎症细胞浸润较少，坏死心肌细胞较少，大量心肌细胞呈冬眠细胞状态存活；而对照组对应区域炎症细胞浸润广泛，坏死心肌细胞较多。细胞凋亡结果显示：实验组梗死边带区域心肌细胞凋亡程度低于对照组[(47.83±16.24)%比(75.80±11.16)%，P<0.05]。结论左心辅助装置对心肌梗死早期心肌卸负荷，可以有效减轻心肌梗死心肌细胞死亡程度，减少炎症细胞渗出，为心肌梗死后续治疗提供良好的心肌细胞基础。

关键词：心肌梗死；左心辅助装置；卸负荷；动物模型；冬眠细胞；小尾寒羊

急性心肌梗死(AMI)是一个具有高发病率与高死亡率的全球性疾病。急性心肌梗死是冠心病最严重的类型，当冠脉管腔狭窄到一定程度，心肌供血减少，心肌的氧需量(MVO2)与供氧量之间存在矛盾，部分心肌细胞进入冬眠状态(myocardial hibernation)[1]，以保护缺血心肌。若供氧与需氧矛盾无法调和，缺氧心肌细胞将发生不可逆性的损伤乃至死亡[2-3 ]。因此，采取适当的干预措施缓解心肌氧的供需矛盾，保护缺血的心肌细胞不发生死亡、甚至恢复到正常状态，正成为心肌梗死治疗的新策略。体外模式氧合器装置(ECMO)、主动脉内球囊反搏(IABP)作为临时、部分心脏辅助已应用于心肌梗死病人，但不能使心肌梗死面积缩小。

左心辅助装置(LVAD)通过辅助心脏部分泵功能，应用于晚期心力衰竭病人[4-5]。但对于急性心肌梗死后是否使用左心辅助装置，目前尚存在争议， 部分学者认为使用辅助装置有可取之处，如：Xydas 等[6]发现左心辅助装置能够显著降低心肌氧需量，Kloner[7]认为借助左心辅助装置的机械卸负荷(mechanical unloading)作用，减少梗死心肌氧需求，从而减少心肌梗死面积；还有研究发现通过对心肌梗死心脏使用左心辅助装置，能限制心肌梗死后的左室重构[8]，与ECMO、IABP相比较，Thiele等[9-10]认为LVAD不受左心功能限制，并对外周循环有充分的支持，即使左心功能受损情况下，仍可对左心室充分卸负荷，并能缓解心肌氧需求，缩小心肌梗死面积。目前也有对心肌梗死及心源性休克病人使用左心辅助装置的个案报道[11]。但也学者认为，心肌梗死病人使用左心辅助装置后，存在血栓形成等并发症，并且与ECMO、IABP等治疗方法相比较，在病人生存率方面，左心辅助装置并无优势。所以左心助装置能否应用于心肌梗死病人还需进一步的证据[12-13]。

通过使用左心辅助装置卸负荷，可以缓解氧供给与需求的矛盾，保护缺血心肌细胞免于死亡，从而为心肌梗死治疗提供良好的心肌细胞基础、赢得治疗时间。本研究制作羊急性心肌梗死模型，用FW-2型轴流血泵进行辅助循环，观察卸负荷干预下心肌细胞的变化。

1材料与方法

1.1实验仪器与材料选用FW-2型轴流式辅助血泵作为左心辅助装置(阜外心血管病医院自行研制)，LEICA DM 6000B正置荧光显微镜(德国)，LEICA sp8激光扫描共聚焦显微镜(德国)，Swan-gaze漂浮导管(爱德华生命科学有限公司，美国)。

1.2实验动物12只成年小尾寒羊，均为雄性，体重(54.2±8)kg，数字法随机分为两组，实验组(MI+VAD)5只，对照组(MI) 7只；实验组制作心肌梗死模型后加FW-2型轴流泵卸负荷，实验组仅制作心肌梗死模型不作进一步处理。该实验按照《北京市实验动物管理条例》进行，本研究得到阜外心血管病医院实验动物福利伦理审查委员会批准。

1.3术前处理术前24 h禁食，12 h禁水；术前抽血检查生化全套，心肌损伤标志物肌钙蛋白(CTnI)、血常规、血气分析等项目。

1.4心肌梗死动物模型制作丙泊酚诱导动物麻醉成功后，气管插管，异氟烷吸入维持全麻，动物右侧卧位，常规消毒、铺无菌巾，取左侧胸第4肋间手术切口，经静脉给予肝素(3 mg/kg)后，保持全血激活凝血时间(ACT)在400 s以上。心表喷洒利多卡因，5-0 prolene线于钝缘支根部结扎，观察钝缘支分布心肌组织颜色变紫、心脏跳动异常，心率增快，心电图显示心肌缺血改变(见图1)，心肌梗死动物模型制作成功。

注：A1为实验组术前心电图；A2为实验组冠脉结扎后心电图；B1为对照组术前心电图；B2为对照组冠脉结扎后心电图。

图1实验组、对照组冠脉结扎前后心电图变化

1.5实验组植入FW-2型轴流泵实验组动物心肌梗死造模前，将FW-2型轴流泵输入端经心尖部进入左心室，输出端用牛颈静脉与降主动脉行端侧吻合，排气后连接牢靠。在心肌梗死动物模型制作成功的同时，开启FW-2型轴流泵，将流速调至接近术前心排量，置入的Swan-gaze漂浮导管记录确认卸负荷成功。检查各吻合口无渗血，血泵转速、流量平稳，留置左侧胸腔负压引流管，常规关胸。对照组仅留置左侧胸腔负压引流管后，术毕。

1.6术后处理实验组、对照组经静脉微量泵持续泵入肝素，将ACT维持于280 s～320 s；并肌肉注射青霉素48×105U，12 h1次；术后1 h、24 h、36 h、48 h、72 h抽血检测记录CTnI，常规饲养。期间检测FW-2型轴流泵转速，并使流量尽量接近心排量，维持卸负荷状态。存活72 h后，全麻动物，原手术部位进入胸腔，静脉推注氯化钾处死动物的同时，FW-2型轴流泵停转，完整取出动物心脏，去除各插管，分别取心肌梗死、梗死边带区域、正常心肌组织置入10%甲醛溶液固定。

1.7组织病理学检查分别取实验组、对照组各自心肌梗死、梗死边带区域、正常心肌组织行固定、包埋、制片，苏木素-伊红(haematoxylin-eosin，HE)常规染色。低倍显微镜下观察心肌细胞死亡及炎症细胞浸润的大体分布，高倍显微镜观察心肌细胞形态及心肌纤维的改变。

1.8免疫组织化学检查两组梗死边带区域各采用数字法随机取4个组织蜡块行TUNEL法细胞凋亡实验，每个蜡块拍取5张照片，每张照片计算超过200细胞，计算细胞凋亡比例。

1.9统计学处理应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。对CTnI结果进行重复测量方差分析，实验组与对照组心肌凋亡细胞所占心肌细胞百分数均采用独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1实验动物总体情况实验组5只，1只结扎冠脉时发生室颤死亡，1只心脏非手术区域小破口术中未发现，术后心脏破裂死亡；存活3只(编号：A、B、C)；对照组7只，4只结扎冠脉时发生室颤死亡，存活3只(编号：D、E、F)。

2.2实验组心肌卸负荷评价(见表1)实验组心肌梗死模型建立后心排量较术前下降(P<0.05)，心肌梗死后心室的容量负荷升高；FW-2型轴流泵启动后心排量较心肌梗死模型建立后上升(P<0.05)；心肌梗死模型建立后肺动脉楔压较术前肺动脉楔压升高(P<0.05)，心肌梗死后心室的容量负荷升高；FW-2型轴流泵启动后肺动脉楔压较心肌梗死模型建立后肺动脉楔压下降(P<0.05)，FW-2型轴流泵启动后心室的容量负荷下降。FW-2型轴流泵卸负荷结果与Jung等[14]描述的经典卸负荷效果相似，卸负荷作用确切。

表1　实验组心脏卸负荷评价(±s)

2.3两组CTnI水平比较(见表2、图2)实验组较对照组CTnI上升及下降均为一个缓慢的过程，相比对照组，实验组的缺血、缺氧心肌细胞是缓慢坏死的过程。实验组与对照组以时间点进行两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2　两组CTnⅠ水平比较

图2　实验组与对照组CTn I均数比较

2.4HE染色实验组：心肌梗死区域存在大量细胞水肿、细胞核水肿，肌束水平波浪样改变及横纹紊乱的

冬眠心肌细胞，其形态特征与Page等[15]描述的冬眠心肌细胞特征相同，同时少量炎症细胞浸润。对照组：心肌坏死破坏程度较大，仅留有视野中央部分心肌纤维未被破坏，病理显示大量心肌细胞破坏崩解并炎症细胞渗出。

2.5TUNEL法检测细胞凋亡情况(见图3)TUNEL标记的细胞核被荧光激发后呈黄绿色，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记后细胞核被荧光激发后呈蓝色。实验组细胞凋亡率低于对照组[(47.83±16.24)%比(75.80±11.16)%，P<0.05]。提示实验组梗死边带区域心肌细胞凋亡程度低于对照组。

注：A为实验组；B为对照组。

3讨论

急性心肌梗死是心血管疾病中最危重的紧急事件之一，由于心肌细胞大量死亡，心脏泵功能衰竭，导致该病发病凶险，死亡率高；同时由于大量心肌细胞死亡，炎症细胞渗出引起的左室重构与心脏破裂及真、假室壁瘤形成等严重并发症和心脏扩大、心力衰竭有关，也是影响AMI近远期预后的主要原因之一[16]。如何挽救更多的缺血、缺氧濒临死亡的心肌细胞，同时减轻心肌梗死后心室重构是心肌梗死治疗的目的之一。本实验在建立羊急性心肌梗死模型的基础上，成功地运用FW-2型轴流血泵进行辅助循环，有效减少了缺血左室的容量负荷后，代表心肌破坏的CTnI、心肌凋亡以及病理结果均证实，通过对心肌梗死动物模型使用左心辅助装置，使心肌梗死心肌卸负荷，能够有效减少心肌梗死心肌死亡、破坏，使原本将要死亡的心肌细胞在术后72 h仍以冬眠心肌细胞形式存在。

基于本实验结果认为，在心肌梗死早期通过使用左心辅助装置辅助心肌梗死心肌泵功能，能增加心排血量，维持脏器灌注，保护脏器功能，最主要的是能够有效保护缺血、缺氧心肌，使本应死亡的心肌梗死心肌细胞转变为冬眠心肌细胞而存活，从而为经皮冠状动脉介入(PCI)或心脏血管重建赢得时间，增加手术成功率。心肌炎症细胞浸润是心肌梗死后左室重构的主要原因之一。

本实验结果显示，在心肌梗死早期使用左心辅助装置，能有效减少炎症细胞浸润，因此认为使用左心辅助装置能减轻心肌梗死后左室重构的程度，并改善AMI近、远期预后。

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(本文编辑郭怀印)

Research on the Effects of Volume Unloading on Myocardial Cells with Left Ventricular Assist Device During the Early Stage of Myocardial Infarction

Gan Yu，Zhou Jianye，Hu Shengshou，Tang Yue，Yang Xinwei，Chen Haibo，Yan Xiaoqian，Sun Jiakang

The First Clinical College，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the changes of cardiomyocyte after left ventricular assist device(LVAD) unloading in a ovine model of acute myocardial infarction (AMI)，in order to provide the evidence that LVAD could be used in AMI.MethodsAMI models were established in six adult sheep by ligation of circumflex coronary artery.Three of them were mechanically unloaded with an continue-flow LVAD (FW-2 axial pump) with heart beating.The others without LVAD supporting served as control.Postoperative 12 hours，24 hours，36 hours，48 hours，72 hours，CTn I and other routine serum items were examined to evaluate the damage of cardiomyocytes.After 72 hours，the hearts were harvested for histological examinations.TUNEL staining was performed to evaluate the apoptosis of cardimyocytes.ResultsThere were differences in CTn I value in each time point between two groups.Inflammatory cells infiltration was less both in the peri-infarction and infarction area of unloading group than those of control group.A large number of myocardial cells were in hibernation status.And the myocardial cell apoptosis was significantly lower than that in control group[(47.83±16.24)% vs (75.80±11.16)%，P<0.05)].ConclusionThe results suggest that early assistance with an LVAD in AMI can maintain myocardial cells in hibernation status，and inhibit apoptosis and inflammatory cells infiltration.These may provide a good condition for myocardial infarction treatment.

Key words：myocardial infarction；left ventricular assist device；unloading；animal model；myocardial hibernation；small tailed han sheep

(收稿日期：2015-12-18)

Corresponding Author：Zhou Jianye(State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing，100037，China)

中图分类号：R547.2R256.2

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.012

文章编号：1672-1349(2016)09-0963-04

通讯作者：周建业，E-mail：zhoujianye@fuwaihospital.org

基金项目：国家自然科学基金(No.81300183)；人工心脏专项基金[No.医科函(2014)58号]