替米沙坦通过调节Krüppel样因子4的表达延缓心肌纤维化

尚粉青　张玎　赵朝　雷霆

710002 西安市第一医院心内三科(尚粉青、赵朝)；710068 西安,陕西省人民医院血液科(张玎)；710061 西安交通大学医学院心血管研究中心(雷霆)



·基础研究·

替米沙坦通过调节Krüppel样因子4的表达延缓心肌纤维化

尚粉青张玎赵朝雷霆

710002 西安市第一医院心内三科(尚粉青、赵朝)；710068 西安,陕西省人民医院血液科(张玎)；710061 西安交通大学医学院心血管研究中心(雷霆)

【摘要】目的研究SHR大鼠心肌Krüppel样因子4(KLF4)及其相关因子变化，同时观察替米沙坦治疗后的效果。方法10周左右的SHR大鼠分别给予生理盐水和替米沙坦10 mg·kg-1·d-1干预(WKY为对照组)。8周后测血压，左室重量及左室重量指数评定左室肥厚情况；同时观察心肌组织中KLF4、内皮一氧化氮合酶(eNOS)及纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)、基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)和Ⅳ型胶原的mRNA和蛋白表达水平的变化。为进一步明确其机制，用AngⅡ刺激内皮细胞，同时测定KLF4的表达进一步明确病理机制。结果SHR大鼠血压、左室重量(LVW)及左室重量指数(LVW/BW)较WKY大鼠明显增加(均为P<0.05)，替米沙坦可以显著降低血压，逆转SHR大鼠的LVW及LVW/BW变化(均为P<0.01)。SHR大鼠KLF4、eNOS的mRNA及蛋白表达水平较WKY大鼠显著降低(均为P<0.05)，而替米沙坦治疗组KLF4的表达较SHR组明显增加(均为P<0.05)；相反，SHR大鼠PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的mRNA及蛋白水平较WKY大鼠明显增加(均为P<0.05)，而替米沙坦治疗后较SHR组明显降低(均为P<0.05)。AngⅡ作用于内皮细胞，eNOS的磷酸化明显降低(2.37±0.22比1.57±0.31)(P<0.05)，同时PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的表达明显增加(均为P<0.05)，过表达KLF4可以使eNOS的磷酸化显著回升(1.57±0.31比2.08±0.28)(P<0.05)，同时PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的表达较AngⅡ作用下明显减低(均为P<0.05)。结论KLF4在高血压大鼠心肌心肌纤维化过程中发挥重要作用，替米沙坦降压治疗可以明显延缓或逆转此病理过程。

【关键词】替米沙坦；高血压；纤维化；Krüppel样因子- 4

高血压引起的心肌纤维化是高血压性心脏病的重要病理过程。研究表明，在心肌纤维化过程中，心肌细胞增生及间质纤维化与心肌血管的相对供血不足，是促进心功能不全发生和发展的重要原因。在心肌纤维化过程中，心肌血管内皮细胞功能障碍起着重要的作用，特别是内皮细胞纤溶酶原激活抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)及基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达失平衡，从而促进细胞外基质合成增加，降解减少，细胞外基质堆积，严重影响心脏功能。

肺Krüppel样生长因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是锌指Krüppel样转录因子家族的成员之一，在体内多种组织广泛分布[1]。在心血管疾病研究中发现，KLF4在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞均有表达，在内皮细胞过表达KLF4可以刺激抗炎和抗栓基因的表达，如eNOS 和血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)[2]。KLF4亦可以结合到平滑肌基因SM22a的启动子上来调节它的转录。但是其在心脏组织中特别是高血压心肌纤维化的作用仍未见报道。本研究使用高血压动物模型，观察KLF4及其相关因子在高血压心肌组织中的表达变化及替米沙坦的影响，并进一步明确其病理机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物选用8～10周SPF级雄性SHR和WKY大鼠(体重300～350 g)作为研究对象，购于北京维通利华实验动物有限公司。

1.1.2脐静脉内皮细胞的分离与培养人脐静脉内皮细胞标本取自西安高新医院妇产科孕妇足月正常娩出的脐带组织。于无菌条件下获得新生儿脐带(长约15～20 cm，无破损，无钳夹痕迹)，置于冰的脐带保鲜液(M199培养基 40%，100×AB/M 溶液 0.8%，1 mol/L HEPES溶液 0.4%，肝素钠注射液 0.144%)中，6 h内进行HUVECs分离。0.1%的胶原酶灌注消化法分离HUVECs细胞。0.125%胰蛋白酶消化传代培养，取生长良好的第2～3代细胞用于实验。

1.1.3药物、试剂及仪器替米沙坦购自勃林格殷格翰制药有限公司。主要试剂：AngⅡ购自Sigma公司；pAd-KLF4过表达腺病毒由西安交通大学心血管研究中心赠予。PCR引物(KLF4、eNOS、PAI-1、TIMP-1、Ⅳ型胶原)：生工(上海)有限公司合成。β-actin抗体及Ⅳ型胶原抗体购自Santa Cruz公司；eNOS抗体、phospho-eNOS(S1177)抗体、caspase-1抗体及TIMP-1抗体均购自美国Cell Signaling公司；PAI-1购自Abcam公司。蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(德国Roche公司)，ECL发光液(Vazyme公司，Millipore公司)，Trizol 试剂(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCR SuperMix逆转录试剂盒(Vazyme公司)，PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余试剂为国产分析纯。主要仪器： ALC无创鼠尾动脉血压测定系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，实时定量PCR仪及梯度PCR仪(美国Applied Biosystems 公司)，WB电泳仪和电泳槽、WB半干转膜槽(BIO-RAD公司)，自动洗片机(柯达公司)。

1.2方法1.2.1动物分组及处理20只10周左右的SHR大鼠(WKY大鼠10只作对照组)，适应环境1周后测定鼠尾动脉血压。随机分成高血压组及替米沙坦治疗组；替米沙坦组给予替米沙坦10 mg·kg-1·d-1每天灌胃治疗，WKY及SHR 组给予生理盐水。疗程8周，其中4周末、8周末均测定鼠尾动脉血压。8周末，血压测定完毕后。CO2麻醉的方法处死大鼠，取其心尖部心脏组织，液氮快速冰冻，-80℃保存备用。所有试验操作已得到西安市第一医院伦理委员会批准。1.2.2血压、体重、左室重量测定用尾袖法测鼠尾动脉收缩压。先将大鼠用配套的固定器固定，建议30℃先加热5 min，再将鼠尾套入脉搏感应器内。打开配套生理记录仪或相关软件，监测脉搏，待出现平稳脉搏后，充气加压使之超过收缩压30 mmHg(压力达到收缩压水平时脉搏搏动消失，据此判断)，然后缓慢减压，经压力换能器和放大器连接于生物机能实验系统记录血压。每只鼠连续测量收缩压3次，间隔60 s，取其平均值。大鼠处死后，迅速开胸取心脏，用冰生理盐水冲洗干净，去除大血管、右室及左右心房，滤纸吸干水分，左心室称重为LVW，测左室重量指数(LVW/BW)来评价左室肥厚(LVH)程度。

1.2.3Western Blot分析取心尖部心脏组织40 g/只，剪碎组织，加入蛋白裂解液约300 ml，匀浆机匀浆，3次，每次30 s；液氮冻融3次，4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清，ABC法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，95℃，8 min蛋白变性。10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(上层胶30 mA，30 min；下层胶50 mA，90 min)，转膜(230 mA，2 h)，5%的脱脂牛奶(TTBS配制)封闭1 h，孵一抗4℃过夜，TTBS洗3遍，每遍5 min；孵二抗，室温1 h；ECL发光，自动洗片机洗片。标定Marker，进行扫描和分析。

1.2.4Real time-PCR取心尖部心脏组织30 g，剪碎组织，加入Trizol提取RNA，RNA浓度采用紫外分光光度计检测。取心肌组织2 μg总RNA进行反转录(参照HiScriptTMqPCR SuperMix逆转录试剂盒说明书)。逆转录得到的cDNA进行实时定量PCR反应(参照TaqMan universal PCR Master Mix说明书)。PCR引物序列见表1。

表1　实时定量PCR引物序列

1.3统计学方法

2结果

2.13组大鼠血压、BW、LVW及LVW/BW的比较

治疗前SHR大鼠血压显著高于WKY组大鼠血压(P<0.01)，给予替米沙坦治疗过程中可见SHR大鼠血压逐渐下降，在4周末测血压已经明显下降(P<0.01)，8周末较4周末又有轻度下降(P<0.01)。见图1。SHR大鼠LVW及LVW/BW较WKY大鼠明显增加，替米沙坦可以明显逆转SHR大鼠的LVW及LVW/BW变化。见表2。

图1　3组大鼠实验过程中血压变化及8周末血压对比(WKY组n=10，SHR组n=10，SHR+替米沙坦组n=9)

组别只数BW(g)LVW(mg)LVW/BW(mg/g)WKY9332.52±12.54695.21±62.542.09±0.37SHR8326.45±32.65966.48±78.28a2.96±0.35aSHR+替米沙坦9306.65±13.59760.52±58.31b2.48±0.27b

注：与WKY组相比，aP<0.05；与SHR组相比,bP<0.05

2.23组大鼠心肌组织KLF4及其相关因子的mRNA水平表达变化

SHR大鼠KLF4、eNOS的mRNA表达水平较WKY大鼠显著降低，而替米沙坦治疗组KLF4的表达较SHR组明显增加；相反，SHR大鼠PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的mRNA表达水平较WKY大鼠明显增加，而替米沙坦治疗后较SHR组明显降低。见图2。

2.33组大鼠心肌组织KLF4及其相关因子的蛋白水平表达变化

SHR大鼠KLF4、eNOS的蛋白表达水平较WKY大鼠显著降低，SHR大鼠PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的蛋白表达水平较WKY大鼠明显增加，而替米沙坦治疗后KLF4、eNOS的蛋白表达较SHR大鼠显著增加，PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的蛋白表达水平明显降低。见图3。

2.4过表达pAd-KLF4可以逆转Ang Ⅱ 对内皮细胞的损伤作用

Western结果显示Ang Ⅱ 可以使内皮细胞eNOS的磷酸化明显降低，同时PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的表达明显增加；过表达pAd-KLF4可以使eNOS的磷酸化显著回升，同时PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型胶原的表达较单纯Ang Ⅱ 作用下明显减低。上述结果表明，KLF4所致内皮功能障碍在心肌纤维化过程中起重要作用。见图4。

3讨论

近年研究报道，KLF4具有抗炎、保护内皮、抗凝血防止血栓形成等功能。减少KLF4的表达可以增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激产生的血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和组织因子[2]。在一项研究中，内皮细胞过表达KLF4可明显降低TNF-α导致的E-选择素和VCAM-1的表达[3]。同时KLF4抑制PAI-1的表达，有明确的抗凝作用。在平滑肌细胞，有研究证明，KLF4可以抑制某些特异基因(SM22α，αSAM等)的表达从而调控血管平滑肌的表型[4-5]。本研究亦证实，在心肌组织KLF4减少的情况下PAI-1表达明显增多，而PAI-1对TIMP-1有明确的抑制作用，促进细胞外基质增生及纤维化进程。而对于KLF4在心肌纤维化中的详细机制，本研究主要针对其在血管内皮细胞上作用做了部分探讨，高血压引起的RAS系统的激活，使循环及局部的AngⅡ浓度均升高，AngⅡ可以明显降低KLF4的表达，从而PAI-1等表达增加，细胞外基质成分增加。过表达KLF4可明显逆转此效应。

与WKY组相比，aP<0.05，bP<0.01；与SHR组相比，cP<0.05图2　3组大鼠心肌组织KLF4及其相关因子的mRNA表达变化(WKY组n=10，SHR组n=10，SHR+替米沙坦组n=9)

与WKY组相比，aP<0.05，bP<0.01；与SHR组相比，cP<0.05图3　3组大鼠心肌组织KLF4及其相关因子的蛋白表达变化(WKY组n=10，SHR组n=10，SHR+替米沙坦组n=9)

与WKY组相比，aP<0.05；与SHR组相比，bP<0.05图4　过表达KLF4可以逆转AngⅡ对内皮细胞的损伤作用

本研究证实，替米沙坦减轻心肌纤维化是与KLF4的表达变化有关，过表达KLF4可以明显减少PAI-1等的表达，减轻细胞外基质集聚。研究表明，层流切应力及他汀类药物可以促进KLF4的表达[6-7]，层流切应力通过磷脂酰肌醇-3-激酶调节KLF4的表达，同时又可以通过AMPK依赖的MEK5/ERK5/MEF2通路诱导KLF4的表达。有报道替米沙坦可以磷酸化AMPK，其是否通过AMPK途径诱导KLF4表达仍需进一步验证。

总之，高血压治疗的主要目标即减轻其心脑血管并发症。本研究初步在组织水平上观察了替米沙坦对高血压心肌纤维化的有效缓解及其相关机制。因此，积极合理应用药物减缓心肌纤维化、使受损的左心室收缩和舒张功能得以改善，从而降低各种心血管病并发症的发生率和死亡率，改善高血压患者的预后，有着重大的临床价值。

利益冲突：无

参考文献

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(本文编辑：周白瑜)

Telmisartan reverses myocardial fibrosis by regulating the expression of Krüppel-like factor 4

ShangFenqing，ZhangDing，ZhaoZhao，LeiTing

DepartmentofCardiology，NO. 1HospitalofXI′ANCity，Xi′an710002，China(ShangFQ，ZhaoZ)；DepartmentofHematology，ShaanxiProvincialPeople′sHospital，Xi′an710068，China(ZhangD)；CardiovascularResearchCenter，MedicalSchool，Xi′anJiaotongUniversity，Xi′an，710061，China(LeiT)

【Abstract】ObjectiveTo explore the change and the effect of telmisartan on Krüppel-like factor 4 and its related factors in SHR rats myocardial fibrosis. MethodsTen-week-old male SHR rats were fed standard chow diet and treated with telmisartan (10 mg·kg-1·day-1) for 8 weeks，while WKY rats are used as control，fed standard chow diet and treated with normal saline. Systolic arterial pressure was measured by tail-cuff plethysmography. The left ventricular weight and left ventricular mass index were used to evaluate the ventricular hypertrophy. At the same time，we observed the changes of mRNA and protein of KLF4，endothelial nitric oxide synthase (eNOS)，plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)，matrix metalloproteinase inhibitor-1 (TIMP-1) and collagen type Ⅳ in the myocardial tissue. ResultsThe blood pressure，left ventricular mass (LVW) and left ventricular mass index (LVW/BW) of SHR rats increased significantly comparing with WKY rats，telmisartan can significantly reduce blood pressure，LVW and LVW/BW. The mRNA and protein levels of KLF4 and eNOS of SHR rats decreased significantly than that in WKY rats，while telmisartan increased their level. The mRNA and protein level of PAI-1，TIMP-1 and Collagen type Ⅳ of SHR rats increased significantly than that in WKY rats，whereas telmisartan eliminated these effect. Overexpression KLF4 in endothelial cell can reverse the effect of AngⅡ. ConclusionsKLF4 plays an important role in the process of myocardial fibrosis，telmisartan treatment can significantly slow or reverse the pathological process through KLF4.

【Key words】Telmisartan;Hypertension;Fibrosis;Krüppel-like factor 4

(收稿日期:2015-10-12)

Corresponding author：Shang Fenqing，Email：shangfenqing@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2016.02.013

通讯作者：尚粉青，电子信箱：shangfenqing@163.com