镁对人血管平滑肌细胞钙化的作用

孙文学，张明慧，刘毅，苏震（.温州医科大学附属第一医院 肾内科，浙江 温州 3505；.东营市胜利油田中心医院 肾内科，山东 东营 57000）



镁对人血管平滑肌细胞钙化的作用

孙文学1，张明慧2，刘毅1，苏震1
（1.温州医科大学附属第一医院 肾内科，浙江 温州 325015；2.东营市胜利油田中心医院 肾内科，山东 东营 257000）

［摘 要］目的：研究镁对高钙高磷诱导的人血管平滑肌细胞（hVSMC）钙化的影响。方法：无菌条件下提取胎儿脐动脉平滑肌细胞，分为正常对照组（A组）、高钙高磷组（B组）、高钙高磷+硫酸镁组（C组）。B组、C组培养3 d后，部分（B1组、C1组）继续高钙高磷培养液培养，部分（B2组、C2组）换用普通培养液培养。于12 h、24 h、72 h、第4、第7、第10天测定细胞层钙含量，并采用Western blot法测定核心结合因子1（cbfa1）、磷酸核糖焦磷酸合成酶2（Prps2）蛋白表达水平。结果：B组钙含量升高，C组较B组、C1组较B1组、C2组较B2组，钙含量均明显下降（P＜0.05）。Western blot结果显示，12 h、24 h、72 h B组Cbfa1表达升高，C组表达降低（P＜0.05）；第4、第7、第10天，C1组较B1组、C2组较B2组，Prps2表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：高钙高磷促进hVSMC钙化，镁抑制了hVSMC钙化进展，激活了Prps2蛋白表达，促进了钙化消退。

［关键词］镁；平滑肌细胞；成骨样转化；钙化；核心结合因子1；磷酸核糖焦磷酸合成酶2

终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）即尿毒症已成为重要的公共卫生问题。心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是尿毒症患者的首位死亡原因。研究显示，血管钙化尤其是中膜钙化是导致尿毒症患者CVD病死率升高的主要原因之一，同时，也是CVD的独立危险因素及预测因素［1］。目前研究已证实血管钙化是一个受多因素调控的、与骨发生类似的、主动的可调节过程，其中心环节是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）转分化为成骨样细胞，表达骨化及矿化相关蛋白及发生凋亡的过程［2］。而核心结合因子a1（core-binding factor a1，Cbfa1）是VSMC转分化为成骨样细胞的标志性蛋白，且已证实停止钙化干预措施后血管钙化是可以主动消退的［3-4］。镁除了参与许多酶的活化外，在骨骼、矿物质代谢、血管钙化方面也起着重要作用。研究发现镁可以减轻牛VSMC的钙化［5］，对人VSMC（hVSMC）的钙化也有抑制作用［6-8］，但具体机制尚不清楚。本课题组前期研究［9-10］发现磷酸核糖焦磷酸合成酶2（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，Prps2）是促进大鼠血管钙化消退的焦磷酸合成相关基因，而Prps2激活剂绝对需要Mg2+，故本研究观察镁对高钙高磷条件下hVSMC成骨样转化的作用及其可能机制。

1　材料和方法

1.1主要试剂 DMEM高糖培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），5%山羊封闭血清（北京Solarbio公司），二甲基亚砜、茜红素S（美国Sigma公司），钙离子检测试剂盒（南京建成科技有限公司），引物（美国Invitrogen公司），SYBR Green real-time PCR MasterMix（Toyobo公司），蛋白Marker、BCA蛋白分析试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），抗GAPDH单抗、抗α-SMA单抗、抗Cbfa1单抗（美国Abcam公司），抗Prps2单抗（美国Abgent公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和IgG辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG（美国Bioworld公司），硫酸镁（上海博蕴生物科技有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞提取及培养：无菌条件下取温州医科大学附属第一医院产科胎儿（男婴，足月）脐带，长约5 cm，于超净工作台上操作，将脐带置于10 cm培养皿中，剥离脐动脉（2条），眼科剪将剩余血管组织剪成1 mm×1 mm组织小块，无菌吸管吸取组织块至0.25%胰酶中消化离心，用1 mL移液器吸出上清液，用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养液培养冲悬离心管内细胞，并将细胞悬液转移至5 mL培养瓶中；细胞培养于5% CO2培养箱中，37 ℃恒温培养，3 d后倒置显微镜下观察细胞，细胞贴壁后予高糖DMEM培养液换液。

1.2.2细胞鉴定：细胞培养6 d后，采用SP法对hVSMC a肌动蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）进行免疫组织化学染色，贴壁于血盖片上的原代及第4代hVSMC依次作处理。a-SMA阳性染色以胞质出现棕黄色或棕褐色为准。

1.2.3实验分组：实验分空白组（A组）、高钙高磷组（B组）、高钙高磷+硫酸镁组（C组）3组。B组、C组hVSMC培养至细胞融合70%左右时换用含高钙高磷（磷3.0 mmol/L，钙2.5 mmol/L）培养液继续培养以诱导钙化。培养3 d后，一部分（B1组、C1组）继续培养于高钙高磷培养液中，另一部分（B2组、C2组）换用普通培养液继续培养。硫酸镁溶液浓度为3.0 mmol/L。

1.2.4钙化模型鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态，茜红素S染色法观察钙沉积。

1.2.5钙含量测定：六孔板培养细胞，分别于12、24、72 h及4、7、10 d后，收集各组细胞，吹打成悬浮状态后，用无菌PBS液洗涤各组细胞3次，每次3 min，各孔加入0.6 mol/L盐酸0.5 mL，37 ℃脱钙24 h，收集盐酸悬液，盐酸悬液中钙含量用甲氧-酚酞络合酮方法测定。将脱钙后的细胞用1×PBS洗涤3次后，用0.1 mmol/L氢氧化钠0.1 mL与1% SDS（十二烷基硫酸钠）溶解细胞，测细胞内钙含量，BCA法测蛋白含量，并以蛋白含量标准化钙含量。

1.2.6Western blot法检测Cbfa1、Prps2的表达：按照试剂盒要求，分别于12 h、24 h、72 h提取各组细胞总蛋白，置于-80 ℃保存，BCA法测定蛋白浓度，每个样本取30 μg蛋白，经SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜上，封闭2 h，分别加入抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜（10 min，3次），再加入山羊抗兔的二抗（1∶5 000稀释），孵育2 h，TBST洗3次后，试剂盒显色，底片经扫描仪透扫后，Quantity One软件进行定量分析，测得Cbfa1蛋白表达；第4、第7、第10天提取各组总蛋白，置于-80 ℃保存，BCA法测定蛋白浓度，经蛋白定量、转膜、免疫反应、化学发光、显影、定量和图像分析测得Prps2蛋白表达。

1.3统计学处理方法 采用SPSS18.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，C1与C2、B1与B2组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1hVSMC的鉴定 原代培养获得的细胞呈典型的hVSMC形态：细胞长梭形或多边形，胞质丰富，细胞核居中，倒置显微镜下观察细胞生长呈典型的“峰谷样”。免疫组织化学α-SMA染色见细胞胞浆内α-SMA表达丰富（见图1）。α-SMA染色阳性率超过95%，纯度符合实验要求。

图1　hVSMC的α-SMA鉴定（×200）

2.2hVSMC的钙化鉴定 平滑肌细胞生长至70%左右时换用钙化培养液，继续培养9 d，倒置显微镜下观察，细胞由长梭形变为短杆状或不规则形态。茜红素S染色，可见钙化的平滑肌细胞有橘红色团块状沉积（见图2）。

图2　茜红素S染色（×200）

2.3各组平滑肌细胞钙含量比较 培养12、24、72 h后，与A组比较，B组钙含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养12、24、72 h后C组与B组比较，钙含量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养4、7、10 d后C1组与B1组比较，C2组与B2组比较，钙含量均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明硫酸镁对VSMC钙化的进展及消退均有作用（见表1-2）。

表1　12、24、72 h各组平滑肌细胞钙含量测定（n=3，±s，μg/mg）

表2　4、7、10 d各组平滑肌细胞钙含量测定（n=3，±s，μg/ mg）

2.4各组钙化相关蛋白的表达 A组hVSMC中Cbfa1蛋白表达量较低，细胞培养24、72 h B组Cbfa1表达较A组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），培养12、24、72 h时C组较B组表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3　不同时间点平滑肌细胞Cbfa1蛋白的表达（n=3，±s）

表3　不同时间点平滑肌细胞Cbfa1蛋白的表达（n=3，±s）

与A组比：aP＜0.05；与B组比：bP＜0.05

细胞培养各时间点12 h　24 h　72 h A　0.181±0.001ab　0.170±0.001ab　0.601±0.015abB　0.180±0.000ab　0.194±0.003ab　0.944±0.006abC　0.178±0.002ab　0.178±0.000ab0.646±0.008ab组别

各组细胞培养4、7、10 d，C1组Prps2表达较B1组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着时间延长增加明显；C2组较B2组，在4、10 d时Prps2表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4　不同时间点平滑肌细胞Prps2蛋白的表达（n=3，±s）

表4　不同时间点平滑肌细胞Prps2蛋白的表达（n=3，±s）

与A组比：aP＜0.05；C1与B1组比：bP＜0.05；C2与B2组比；cP＜0.05

细胞培养各时间点4 d　7 d　10 d A　0.050±0.001ac　0.066±0.000ac　0.166±0.000acB1　 0.106±0.000ac　0.134±0.001ac　0.175±0.000acC1　 0.115±0.004ab　0.167±0.002ab　0.343±0.002abB2　 0.112±0.000ac　0.211±0.004ac　0.241±0.000acC2　 0.185±0.002ac　0.212±0.000ac　0.226±0.002ac组别

3　讨论

血管钙化是一种异位钙化，在ESRD患者中十分常见，尤其是维持性血液透析后，血管钙化发生早、发展迅速，导致CVD的病死率明显增加。矿化的促进力和矿化的抑制力之间是否维持着动态平衡，决定着血管钙化的产生和消退。因此聚焦矿化的抑制因素将有助于寻找防治血管钙化的新途径。

镁为大约300种酶的辅助因子和天然钙通道阻滞剂，在生理和病理生理方面，扮演重要角色。研究显示，镁缺乏与增加代谢综合征和2型糖尿病风险及慢性心力衰竭中致命性心脏事件以及血液透析患者动脉粥样硬化和血管钙化有关［11］。低镁血症与肾脏病发生及血管钙化关系密切［12］。研究发现，补充镁可延缓血液透析患者动脉钙化的进展［13］。低剂量和高剂量硫酸镁明显缓解维生素D3加尼古丁诱导的SD大鼠心血管组织的钙化，以剂量依赖性的方式降低血管钙化和减少血管损伤［14］。镁逆转血管钙化的可能机制有：①逆转VSMC中钙的沉积、羟磷灰石结晶的发生、生长［15］；降低Cbfa1、碱性磷酸酶的表达，抑制并部分逆转血管钙化；②通过抑制钙通道活性，抑制VSMC成骨样转分化［16］；③通过短暂受体潜能通道家族（transient receptor potential melastatin，TRPM）7抑制钙转移入细胞内及基质小泡中，从而下调Pit1，抑制磷进入细胞，抑制Cbfa1介导的VSMC转分化［17］。

本课题组前期研究［9-10］显示，焦磷酸盐合成相关基因Prps2等基因在大鼠血管钙化消退过程中差异表达，在原组织中表达增高，促进血管钙化消退。Prps属于激酶类，是催化从ATP和核糖-5-磷酸合成磷酸核糖焦磷酸的一个酶家族［18］。Prps2基因位于x染色体短臂p22.2-p22.3区［19］，Prps家族编码的Prps蛋白是体内嘌呤、嘧啶核苷酸从头合成和补救合成的关键酶，是核苷酸代谢的重要调节因子，在细胞增殖中发挥重要作用［19］。Prps2在增殖较快的组织（如胸腺、肺、胃、小肠等）中表达量高［20］。其中Prps2激活剂绝对需要Mg2+，包括与ATP形成Mg2+-ATP及游离的Mg2+。Mg2+与Prps的结合促进Mg2+-ATP与Prps的结合。Ca2+对重组Prps2起抑制作用，无机磷为维持Prps活性所必需［21］。

本实验培养胎儿脐动脉平滑肌细胞作为观察对象，采用高钙高磷环境（钙2.5 mmol/L，磷3.0 mmol/L）诱导hVSMC钙化，结果显示：12 h开始B、 B1、B2组hVSMC的钙含量开始明显增加，一直持续至第10天，且随着时间的延长，钙含量升高明显，形成明显的钙盐沉积，茜素红S染色可见细胞团块处有橘红色的钙盐沉积形成，说明高钙高磷诱导VSMC钙化成功。加入硫酸镁后（C、C1、C2组）在钙化进展及消退过程中hVSMC钙含量明显降低，说明硫酸镁抑制了hVSMC血管钙化的进展，且促进了血管钙化的消退。

正常情况下，hVSMC中Cbfa1蛋白表达量较低，高钙高磷诱导后，B组12、24、72 h均表达增高（P＜0.05），且随着时间延长增加明显，与B组比较，C组Cbfa1蛋白表达量降低，说明高钙高磷诱导hVSMC钙化成功，硫酸镁抑制了hVSMC钙化进展早期Cbfa1蛋白表达，抑制了血管钙化。第4天开始各组Prps2蛋白表达均增高；C1较B1，C2较B2组Prps2蛋白表达增高明显，说明硫酸镁在hVSMC钙化进展及消退过程中激活了Prps2蛋白表达，抑制了hVSMC成骨样转化，促进了hVSMC钙化的消退。

综上所述，ESRD患者的高钙高磷环境对hVSMC有主动调节骨转化的作用，而外源性硫酸镁可能通过激活Prps2蛋白表达，抑制hVSMC钙化进展，促进钙化消退。

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（本文编辑：丁敏娇）

Effect of magnesium on calcification of human vascular smooth muscle cells

SUN Wenxue1，ZHANG Minghui2，LIU Yi1，SU Zhen1. 1.Departmant of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 2.Departmant of Nephrology，the Central Hospital，Shengli Oil Field，Dongying，257000

Abstract:Objective: To investigate the effect of magnesium on calcification of vascular smooth muscle cells （VSMCs） induced by elevated calcium （Ca++） and phosphate （P） culture. Methods: The fetus’s umbilical artery VSMCs were extracted under aseptic conditions and cultured in vitro. Cells were divided into three groups: normal control group （normal concentration of Ca++and P，group A），positive control group （high calcium and phosphate，group B），treatment groups （high calcium and phosphate + magnesium sulfate，group C）. The cells were cultured for 3 days，then Part （B1，C1） were continued to develop in high calcium and phosphate culture medium，Part （B2，C2） were changed to develop in ordinary solution. Respectively the calcium content of cell layer were determinated in calcium content test in the 4，7，10 days. Meanwhile，the protein expression of Cbfa1 and Prps2 were observed by Western bloting. Results: The primary cells were identified，purity of cultures was assessed by positive immunostaining for α-SMA. Compared with negative control group，the sedimentary on the cells layer of experimental group （B） was observed. The calcium content in calcium content test showed that the high calcium and high phosphorus group （B，B1 and B2） increased significantly （P＜0.05），compared with the B，B1 and B2 group，magnesium sulfate group （C，C1 and C2） showed a lower intracellular calcium levels. Western blot test results confirmed that: compared with control group （A），the expression of Cbfa1 increased in B group in 24 hours，72 hours； compared with B group，the expression of Cbfa1 declined in C group in 12 hours，24 hours，72 hours. compared with B1，B2 group，the expression of Prps2 increased in C1，C2 group in 4 days，7 days，10 days，was statistically significant （P＜0.05）. Conclusion: High calcium and high phosphorus promote the VSMCs’calcification. While magnesium has a significant effect to inhibit the VSMCs calcification，activate the Prps2 protein expression，promote the calcification fade.

Key words:magnesium； smooth muscle cell； osteogenesis sample transdifferentiation； calcification； corebinding factor α1； phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2

作者简介：孙文学（1976-），女，浙江温州人，主治医师，硕士。

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY15H270017）；温州市科技局科研基金资助项目（Y20120020）。

收稿日期：2016-01-08

［中图分类号］R453.9

［文献标志码］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.009