大承气汤对脑出血模型大鼠mNSS评分及Nrf2信号通路的影响*

杨树升，　林　丽，　邱明义，　田　青

1湖北中医药大学，武汉　4300612华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系，武汉　4300303武汉市十一医院中医科，武汉　430015



大承气汤对脑出血模型大鼠mNSS评分及Nrf2信号通路的影响*

杨树升1，2，3#，林丽1，2#，邱明义1△，田青2△

1湖北中医药大学，武汉4300612华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系，武汉4300303武汉市十一医院中医科，武汉430015

摘要：目的探讨大承气汤对脑出血大鼠模型的作用及机制。方法使用胶原酶Ⅶ于SD大鼠左侧尾壳核立体定位注射，复制脑出血模型，用低、高剂量大承气汤干预后，采用神经功能缺损评分、普鲁士蓝染色法检测大鼠脑出血后1、3、7、14、28 d时神经功能缺损和脑组织铁沉积的变化，用Western blot法检测脑出血后14 d基底核Nrf2、TNF-α和Arg1的表达水平。结果高剂量大承气汤能有效逆转大鼠脑出血后神经功能受损，减少铁沉积，并下调基底核TNF-α和Nrf2水平，伴Arg1水平上升。结论大承气汤通过Nrf2介导的信号通路改善脑出血后神经功能缺损、减少脑组织铁沉积、促进抗炎性因子Arg1释放和抑制促炎性因子TNF-α释放，从而促进脑出血后脑组织恢复而发挥神经保护作用。

关键词：大承气汤；脑出血；铁沉积；炎性因子；Nrf2

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是由于脑血管脆性增加、破裂致使血液进入脑组织而引起的疾病。ICH不包括外伤性脑出血，属于临床卒中，其死亡率高[1]，幸存者往往伴有长期或终生的神经功能障碍或部分缺失。在美国、欧洲和澳大利亚，约10%～15%卒中为ICH，而在亚洲，该比率为20%～30%，综合全球范围该比率约为9%～27%[2]。目前，在全球范围内，每年新发ICH患者约为200万，预计到2050年该病发病率将翻番[3]。因ICH有高发病率、高死亡率、高致残率的特点，该病历来备受关注。然而迄今为止，ICH发病机制依然不很明确，其临床治疗仍缺乏非常有效的手段[4]，即使是神经外科作为依仗的外科血肿清除术也被证实对患者无多少益处，而且还增加ICH后迟发性损伤风险[5-6]。因此，明确ICH的发病机制及寻找行之有效的治疗手段显得非常必要而且迫切。

ICH属中医“出血性中风”范畴，总属本虚标实之症，其病因及发病机制较为复杂，以王永炎为代表的用通腑化痰以治急性期中风的学派影响深远[7]，临床中以承气汤应用居多。但承气汤对ICH治疗作用的相关研究虽从某些方面进行了探讨，但在病理上有待进一步确证，分子机制上还有待进一步阐释。ICH后红细胞裂解，毒性更强的物质如血红蛋白、血红素和铁被释放出来，从而加重脑继发性损伤，氧化应激是ICH继发性损伤的核心机制之一，与核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)有极大关联。那么ICH后，铁的释放与沉积是否呈现时间规律性，Nrf2信号通路在脑出血模型中是否被激活，大承气汤对其是否有影响，是本研究主要关注的问题。

1材料与方法

1.1药材与试剂

大承气汤：生大黄、芒硝、厚朴、枳实4味药按4：2：3：3的比例配制，以上药物均购自湖北省中医院门诊中药房，经鉴定为正品。厚朴、枳实先煎，生大黄后下，倒出第1次药液，盛装备用，然后加水进行第2次煎煮，2次药液混合，加入芒硝，冲化，过滤，水浴浓缩，制备成含生药1 g/mL的浓缩液，无菌玻璃瓶分装，盖紧，置4℃冰箱备用。使用前水浴复温至37℃，摇匀。胶原酶Ⅶ(Collagenase Ⅶ)购自美国Sigma公司，用生理盐水将其稀释成2.5 U/μL，-20 ℃冰箱保存备用，临用前再用生理盐水稀释成0.2 U/μL待用；亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6]购自北京雷根生物技术有限公司；Nrf2、TNF-α、Arg1抗体购自美国Sigma公司，-20℃冰箱保存，临用前按1∶1 000用抗体稀释液稀释；二氨基联苯胺(DAB)试剂盒，购自北京中杉生物工程公司。

1.2实验动物及分组

3月龄清洁级健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，120只，体重(250±10)g，购自武汉大学实验动物中心。所有动物进行神经功能缺损评分，剔除不合格大鼠后，将其随机分为正常对照组(control group，Con)30只、模型组(model group，Mod)30只、大承气汤低剂量组(low DCQ group，LDCQ)30只、大承气汤高剂量组(high DCQ group，HDCQ)30只，适应性喂养1周后开始正式实验，于脑立体定位后1、3、7、14、28 d等5个时间点分别进行神经功能缺损评分，处死5只制备脑组织切片行普鲁士蓝染色，并于14 d时各组处死5只取新鲜脑组织行Western blot检测。饲养环境和实验操作过程依循“实验动物使用和管理条例”中的相关规定。

1.3大鼠尾壳核脑立体定位注射及给药

除正常组外另3组共90只大鼠用6%水合氯醛行腹腔麻醉(0.6 mL/kg)，常规消毒、备皮后，固定于脑立体定位仪，于两耳中点沿矢状线切开约1.0～1.2 cm长的切口，充分暴露颅骨前囟。定位注射于左侧尾壳核(参考大鼠脑立体定位图谱[8]，Fanklin and Paxinos)，即前囟后0.8 mm、左侧旁开3.5 mm处标记，颅骨钻钻取直径约1.0 mm的小孔，微量注射器吸取含0.4 U胶原酶Ⅶ共2 μL，颅骨下5.5 mm处缓慢注射(约10 min)，留针10 min，缓慢退针。络合碘消毒，涂抹青霉素粉后缝合皮肤，再次络合碘消毒切口。术后6 h开始灌胃，HDCQ组灌胃物质为1 g/mL的大承气汤煎剂浓缩液，给药剂量：1 g/(100 g体重·次)，2次/d；将大承气汤煎剂浓缩液1：1稀释后用于LDCQ组灌胃，按0.5 g/(100 g体重·次)，2次/d的标准进行；正常组和模型组每次均用5 mL生理盐水灌胃，2次/d。以上各组最多灌服7 d。

1.4神经功能缺损评分

术后1、3、7、14及28 d时进行神经功能缺损评分。本实验使用国际上公认的大鼠脑卒中后神经功能缺损评价标准即改良的神经功能缺损评分法(modified neurological severity score，mNSS)对各组不同时间点的大鼠进行神经功能评定[3]。包括平衡木实验、行走测试、反常运动、感觉测试、反射缺失和提尾反射等。评判标准：1～6分认为轻型受损；7～12分认为中型受损；13～18分认为重型受损。

1.5灌流

每组于上述各时间点取3只进行灌注，将钝头灌注针沿大鼠心尖部偏左前方插入主动脉，将预冷的4℃生理盐水约500 mL快速冲进体循环，至肝脏变白后更换4%多聚甲醛500 mL继续灌流。灌注多聚甲醛固定液时先快速冲进体循环，约100～150 mL后调慢速度，以70～80滴/min维持灌注，整个灌流时间持续约1～2 h直至大鼠全身僵硬。然后取脑组织修块后浸泡于4%多聚甲醛进行后固定，置4℃备用。

1.6脑组织切片制备

将后固定至少24 h的脑组织取出，放入20%蔗糖-PBS溶液中至少24 h，沉底后更换30%蔗糖-PBS溶液浸泡至少24 h再次沉底，以彻底脱水。取出，滤纸吸干脑组织表面水分，冰冻包埋剂包埋后行冰冻切片。切片厚度为20 μm，置50%甘油-PBS内于4℃保存备用。

1.7普鲁士蓝染色

尽量挑选同一截面的脑片贴于事先过明胶的载玻片上，铅笔标记，室温自然风干，滴加Perl’s反应液(配制方法：吸取等体积的6%亚铁氰化钾水溶液、10%盐酸，振荡，要求新鲜配制)约0.6～0.8 mL/脑片，充分覆盖脑片，室温孵育9 h(注意：孵育无需避光，但玻片必须加盖，以防染色液挥发)。摇床上双蒸水漂洗5 min×3，室温自然风干，滴加核固红染色液约0.6～0.8 mL/脑片，室温孵育5 min，摇床上双蒸水漂洗5 min×3，室温自然风干，梯度乙醇脱水，按95%乙醇10 min×2，无水乙醇10 min×2顺序进行；二甲苯透明，中性树胶封片，风干，显微镜下观察并采集图像以备分析。

1.8免疫印迹(Western blot)

将备用组织从-80℃冰箱取出匀浆，加入1/3体积的4×buffer，煮沸10 min，超声，BCA法测蛋白浓度后行免疫印迹。将下部胶加入制胶架后加入双蒸水，水平静置约30 min后倒出双蒸水，加上部胶并插入梳齿。约40 min后取出梳齿，标记泳道后固定至电泳槽，加电泳缓冲液后上样，样品一旁加0.6～0.8 μL的预染蛋白Marker后电泳，当电泳至胶底部时即准备转膜。将转膜后的NC膜置5%脱脂奶粉-TBS液中封闭30 min，双蒸水漂洗，敷一抗，平铺，4℃过夜，回收一抗，将孵育一抗后的NC膜置TBS-T缓冲液中振荡洗涤10 min×3，双蒸水漂洗，加入稀释后的IgG荧光标记的羊抗兔或羊抗鼠IRDyeTM的二抗，封膜，平铺，室温避光置于摇床上缓慢振摇1 h后回收二抗，TBS-T缓冲液振洗10 min×3，双蒸水漂洗，Odessy扫描并分析。

1.9统计学处理

2结果

2.1大承气汤对脑出血大鼠神经功能缺损的影响

脑出血大鼠模型术后3 d内神经功能缺损情况有逐渐加重趋势，大承气汤可逆转脑出血大鼠模型神经功能缺损，但低剂量组效果不明显，高剂量组则在3 d时发挥逆转效应(P<0.01)，与1 d时有显著性差异(P<0.05)。具体结果见表1和图1。

组别1d3d7d14d28dCon00000Mod10.18±1.63**14.92±2.93**13.64±3.47**11.91±2.88**9.87±2.13**LDCQ9.41±1.03**11.01±2.37**10.23±1.89**9.21±2.38**6.03±1.25**HDCQ7.38±1.12**8.07±1.22**#5.13±0.82**##△4.17±1.23**#2.93±0.42**##△

与Con组比较，**P<0.01；与Mod组比较，#P<0.05##P<0.01；与LDCQ组比较，△P<0.05

图1　不同剂量大承气汤干预脑出血大鼠模型不同时间点mNSS评分趋势图Fig.1 Changes of mNSS at different time after ICH in rats treated with different doses of Da Cheng Qi Tang

2.2大承气汤对脑出血大鼠模型铁沉积病理改变的影响

普鲁士蓝染色法，又称为普鲁士蓝反应、含铁血黄素染色，是非常经典的组织化学反应，是显示吞噬细胞内或组织间质内三价铁的一种敏感、传统而优良的方法。为观察及评价进入脑组织的铁的沉积，我们采用了常用的反映组织内各种出血性病变的普鲁士蓝染色法。结果显示：胶原酶Ⅶ诱导3 d到28 d期间内，Mod大鼠普鲁士蓝染色着色程度呈进行性升高，并且在28 d时其增加趋势没有改变。说明胶原酶Ⅶ诱导后28 d内，Mod大鼠脑组织内铁沉积病理改变进行性加重。胶原酶Ⅶ诱导后1 d到14 d期间，LDCQ和HDCQ普鲁士蓝染色着色程度呈进行性升高，并且在14 d时达到峰值，随后在28 d时，其增加趋势得到扭转。说明胶原酶Ⅶ诱导14 d后，大承气汤的治疗可以使脑组织内铁沉积病理改变加重趋势得以扭转。具体情况参见图2。

A：各组大鼠在脑立体定位后1、3、14、28 d时脑片的普鲁士蓝染色；B～D：Mod组、LDCQ组和HDCQ组普鲁士蓝染色平均着色程度的比较；E：各组普鲁士蓝平均着色程度演变趋势折线图。第1、3、14 d时HDCQ、LDCQ组与Mod组间无显著性差异，28 d时HDCQ组普鲁士蓝染色平均着色明显降低，与Mod组有显著性差异(P<0.05)(bar=150 μm，n=5)。与1 d比较，*P<0.05 **P<0.01；与3 d比较，##P<0.01；与14 d比较，△P<0.05 △△P<0.01图2　大承气汤对脑出血大鼠模型不同时间点铁沉积的影响Fig.2 Effect of Da Cheng Qi Tang on the iron deposition of ICH rats at different time

2.3大承气汤对脑出血大鼠模型的影响

ICH发生后，包括红细胞在内的血液成分通过被破坏的血脑屏障进入脑组织，局部脑环境发生剧烈改变，如炎症因子的大量释放、聚集等。大承气汤对与氧化应激和炎症反应关系密切的Nrf2等信号通路有否影响是接下来需要探讨的问题。上述普鲁士蓝染色结果说明ICH病程中14 d是一个明显的转折点，因此我们选取14 d时各组大鼠新鲜脑组织匀浆后做Western blot检测。Western blot结果提示：模型组TNF-α水平明显下降，Arg1水平明显下降，Nrf2水平亦明显上升，与对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)，大承气汤能逆转这些变化趋势，尤以大剂量的大承气汤效果显著，详见图3。

A：各组TNF-α、Arg1和Nrf2的Western blot检测结果；B：各组Western blot条带相对灰度值统计结果(n=5)；与Con组比较，*P<0.05 **P<0.01；与Mod组比较，#P<0.05 ##P<0.01图3　各组术后14 d大脑皮层TNF-α、Arg1和Nrf2的表达水平Fig.3 The expression levels of TNF-α，Arg1 and Nrf2 in the brain cortex 14 d after the operation in each group

3讨论

现代中医学界对于ICH治疗的研究及探讨从未间断。据报道[9]，依中医分型，中风属痰热腑实证者占74.17%，故腑气不通在急性期中风病机中居重要地位，所以现代中医临床中应用(或兼用)承气汤类方来治疗ICH的比例日渐加大，尤以大承气汤为最常见[10-11]，但是其对ICH作用机制仍不很明了。

ICH发生后，脑实质内血肿常可引发感觉障碍、运动障碍等一系列神经功能缺损，因此临床上常通过神经功能缺损评分对神经受损情况进行有效评价[12]。动物行为学实验不仅可以评价ICH后残存神经功能，而且可以用来评估治疗手段对神经功能的保护效果。在本实验进行的mNSS检测中，发现ICH大鼠均迅速出现严重的运动障碍，且在ICH后3 d时表现最为明显，低剂量和高剂量大承气汤干预后均能显著改善ICH后神经功能缺损，尤其是高剂量的大承气汤，其改善ICH神经功能缺损起效快而全面。

ICH发生时伴有血脑屏障破坏，红细胞穿过被破坏的血脑屏障进入脑组织，红细胞及血浆内的铁亦随之进入脑组织，脑组织出现铁沉积可致局部脑环境发生改变继而产生继发性损伤[13]，因此铁对ICH病理改变的影响重要而且深远。反映ICH后铁沉积的普鲁士蓝染色结果提示胶原酶Ⅶ诱导后3 d到28 d期间，模型组大鼠普鲁士蓝染色着色程度呈进行性升高，而大承气汤尤其是高剂量的大承气汤可以于脑出血后14 d时逆转脑组织内铁沉积的进行性升高。

ICH发生后的继发性损伤的核心机制包括氧化应激和炎症反应两个方面，两者经由不同或相同的途径对脑组织造成损伤，形成脑水肿、神经元损伤并加重血脑屏障破坏等共同结局。氧化应激被认为与活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生过多密切相关，过多的ROS激活Nrf2、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、核因子活化B细胞κ轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)等抗炎性及促炎性基因的表达，从而引发氧化损伤及修复，这一点已被诸多研究证实[14-15]。此时，过量的ROS会攻击蛋白质、DNA，并引起氧化损伤，包括蛋白质结构的修饰、生物活性的失活、DNA链断裂、点突变、异常的DNA交联等[16]。在人类及动物中，氧化应激被认为参与了许多疾病的发展，或可能加重疾病的症状，其中包括ICH。本研究也发现模型组Nrf2的水平上升，但是大承气汤干预后其水平下降，从该结果看来，似乎使用大承气汤后脑出血大鼠抗氧化损伤的能力反而下降。事实并非如此，因为已经有研究表明在急性炎症中Nrf2上调，但在慢性炎症中，Nrf2水平是下调的，后者与p38影响Keap1和Nrf2间的相互作用导致Nrf2降解有关[17-18]，同时可由GSK-3β介导致Nrf2被泛素蛋白酶降解[19]。实验中我们选取ICH后14 d的基底核区，而非ICH后出现严重炎症反应的ICH急性期，此时该区域的炎症反应呈慢性炎症的特点。我们同时检测了炎性因子TNF-α和抗炎性因子Arg1，发现大承气汤能减低TNF-α水平并上调Arg1水平。因此，ICH后给予大承气汤的治疗，能减轻脑出血局部的炎症反应，并导致局部呈现慢性炎症特点，从而Nrf2水平下调，此时Nrf2水平下调并非意味抗氧化应激及抗炎症反应能力的下降，而是抗氧化应激及抗炎症反应作用后的下调。

综上所述，我们的研究证实了大承气汤尤其是大剂量大承气汤能改善ICH大鼠神经功能缺损、减少ICH后铁的沉积，同时促进抗炎性因子Arg1的分泌并减少炎性因子TNF-α的释放，从而促进ICH恢复，这些作用与Nrf2介导的信号通路密切相关。

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(2015-12-11收稿)

Effect of Da Cheng Qi Tang on mNSS and Nrf2 Signal Pathway in an Intracerebral Hemorrhage Model of Rat

Yang Shusheng1，2，3#，Lin Li1，2#，Qiu Mingyi1△etal

1HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430061，China2DepartmentofPathophysiology，SchoolofBasicMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China3DepartmentofTraditionalChineseMedicine，Wuhan11thHospital，Wuhan430015，China

AbstractObjectiveTo investigate the treatment effects of Da Cheng Qi Tang on the injury of intracerebral hemorrhage(ICH)in rats and the possible mechanisms.MethodsThe ICH model was established by stereotactic injection of collagenase Ⅶ into the left caudate putamen of SD rats.The neural function deficit was detected by modified neurological severity score(mNSS) and the iron deposition in the brain by prussian blue staining at 1，3，7，14，28 d after ICH in rats treated with low- and high-dose Da Cheng Qi Tang.Western blot was used to detect the levels of Nrf2，TNF-α and Arg1 in the left basal ganglia 14 d after ICH.ResultsHigh-dose Da Cheng Qi Tang could effectively reverse the damage on neural function，reduce the iron deposition in the brain of ICH rats，down-regulate the levels of Nrf2 and TNF-α and up-regulate the level of Arg1 in the left basal ganglia.ConclusionDa Cheng Qi Tang protects against ICH injury by improving neurologic deficits，reducing brain iron deposition，promoting the release of the anti-inflammatory factor Arg1 and inhibiting the release of the inflammatory factor TNF-α through the Nrf2 signal pathway.

Key wordsDa Cheng Qi Tang；intracerebral hemorrhage；iron deposition；inflammatory factors；Nrf2

中图分类号：R743.34

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.010

*国家自然科学基金资助项目(No.91539112)；湖北中医药大学人才引进资助项目(中医党字[2014]25号)、青苗计划

#同为第一作者

杨树升，男，1972年生，副主任医师，医学博士，E-mail：bluebagbear@163.com；林丽，女，1974年生，副教授，副主任医师，博士后在读，E-mail：465136032@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：qmy9999@163.com(邱明义)；tianq@mail.hust.edu.cn(田青)