高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响*

曹小年，　胡发涌，　杨　熹，　来森艳，　孙　威，　胡俊波△

华中科技大学同济医学院附属同济医院　1胸外科　2肿瘤研究所　3胃肠外科，武汉　430030



高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响*

曹小年1，胡发涌2，杨熹3，来森艳3，孙威1，胡俊波3△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1胸外科2肿瘤研究所3胃肠外科，武汉430030

摘要：目的构建p55PIK高表达的质粒，筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系，检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段，通过限制性核酸内切酶进行酶切，T4 DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中；将携带p55PIK基因的pcDNA3.1质粒转染LoVo细胞，加入适量的G418筛选(500 μg/mL)，并通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测p55PIK mRNA水平和蛋白水平，进一步通过BrdU/PI掺入法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响。结果成功构建了p55PIK高表达的质粒，并筛选出稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系；在LoVo细胞中高表达p55PIK能够促进细胞S期的进程和DNA的合成。结论成功构建了pcDNA3.1-p55PIK质粒，并筛选出p55PIK稳定高表达的LoVo细胞系，高表达p55PIK能够促进LoVo细胞S期的进程和DNA的合成。

关键词：p55PIK；稳定细胞系；LoVo细胞；细胞周期；DNA合成

磷脂酰肌醇激酶-3-激酶(phosphatidylinositol kinase-3-kinase，PI3K)是生长因子超家族的主要成员之一，其在调控细胞增殖、凋亡、分化，肿瘤发生、发展、侵袭转移和血管生成中发挥着重要的作用[1-3]。PI3K是由调节亚基和催化亚基构成的异二聚体，其中ⅠA类PI3K的催化亚基包括p110α、p110β和p110δ，他们分别由PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD基因编码；调节亚基包括p85α、p85β、p55α、p50α和p55γ，其中，p85α、p55α和p50α由PIK3R3基因编码，p85β由PIK3R2基因编码，p55γ由PIK3R3基因编码[4]。正常生理状态下，调节亚基与催化亚基结合,稳定催化亚基表达并抑制催化亚基活性，当细胞接受外界刺激时，调节亚基与细胞膜上的生长因子受体结合并被磷酸化，进而发生空间结构的改变，暴露出催化亚基的活性基团，活化的催化亚基能够磷酸化PIP2成PIP3，后者能够磷酸化Akt，从而激活下游信号通路[5]。

p55PIK是PI3K调节亚基之一，前期研究发现，p55PIK在多种肿瘤中呈高表达状态，并发挥重要的作用[6-7]。2003年，Xia等[8]发现p55PIK与其他调节亚基的不同在于其N末端特异的24个氨基酸，针对其N末端特异的24个氨基酸，设计并合成了特异性的抑制p55PIK功能的多肽TAT-N24。我们前期研究发现，通过TAT-N24干预p55PIK的功能能够明显抑制结直肠癌细胞的增殖，提示p55PIK在结直肠癌中发挥着重要的作用。为了进一步研究p55PIK的具体作用，我们成功构建了p55PIK高表达的质粒，并筛选了其稳定高表达的LoVo细胞系，以此为工具，检测其对细胞周期和DNA合成的影响。

1材料与方法

1.1实验材料及试剂

结直肠癌LoVo细胞及pcDNA3.1质粒由本实验室保存，LoVo细胞培养于37℃含5%CO2的培养箱中。胎牛血清、DMEM高糖培养液及胰酶购自Hyclon公司；BrdU、GAPDH和p55PIK抗体购自美国Santa Cruz公司，BrdU购自Sigma公司，各种二抗均购自康维公司，各种限制性内切酶购自美国NEB公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR产物胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司，转染试剂Lipofectamine2000及Trizol购自英骏公司。

1.2p55PIK质粒的构建及LoVo高表达稳定细胞系的建立

通过Trizol氯仿的方法提取细胞mRNA并逆转录成cDNA，以cDNA为模板，应用PCR技术将目的基因片段进行扩增(上游引物序列：5′-GGGG-TACCATGTACAATACGGTGTGGAG-3′，下游引物序列：5′-CGGAATTCTTATCTGCAAAGCG-AGGGCA-3′)，PCR条件：95℃预变性5 min，然后扩增32个循环，条件为95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，最后72℃延伸10 min。将PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳并做胶回收，将回收的产物和pcDNA3.1质粒同时进行双酶切(KpnⅠ和EcoRⅠ)，然后将酶切产物以同样的方法进行胶回收，再通过T4 DNA连接酶进行连接(16℃过夜)。将连接产物通过氯化钙法转入大肠埃希菌感受态DH5α，涂含有氨苄青霉素的琼脂糖胶筛选单克隆，摇菌，小提质粒后通过酶切鉴定，并将符合要求的菌液送北京华大公司测序。将测序正确的菌液进行摇菌并大提质粒，将提取的质粒通过Lipofectamine2000转染结直肠癌LoVo细胞，24 h后加入500 μg/mL的G418进行筛选，维持筛选2周后通过Western blot和real-time PCR进行验证。

1.3LoVo细胞周期及DNA合成的检测(BrdU/PI检测法)

将p55PIK高表达的LoVo细胞系和阴性对照的细胞正常培养，待细胞生长至约80%融合度时，加入BrdU(10 μg/mL)处理30 min，胰酶消化细胞后PBS洗2遍，并用75%的冰乙醇固定过夜。将固定好的细胞用PBS洗2遍，加入1 mL洗液(含5%的Tween 20的PBS)破膜后加入1 mL的盐酸(2 mol/L)的洗液，室温放置45 min后加入1 mL的0.1 mol/L的硼砂中和盐酸，加入BrdU(人抗小鼠)一抗，室温孵育1～2 h，加入FITC(山羊抗小鼠)荧光二抗，室温避光孵育30 min，加入100 μL的PI，4℃避光放置15 min后上机检测。

2结果

2.1pcDNA3.1-p55PIK质粒的构建及鉴定

将获得的阳性克隆进行质粒小提，经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切后，通过琼脂糖电泳，在1 000～1 500 bp之间可见一明显条带，送北京华大公司测序结果与GenBank报道的序列完全一致，表明pcDNA3.1-p55PIK质粒构建成功。见图1。

M：10 000 bp核酸Marker；1：空质粒酶切；2：pcDNA3.1-p55PIK质粒酶切图1　高表达p55PIK质粒成功构建Fig.1 Successful construction of p55PIK high-expression plasmid

2.2LoVo高表达稳定细胞株的筛选及鉴定

LoVo细胞转染pcDNA3.1-p55PIK质粒及相应的阴性对照后，加入500 μg/mL的G418筛选细胞，2周后收集细胞，通过real-time PCR和Western blot方法检测p55PIK mRNA和蛋白水平的表达。结果表明：高表达p55PIK组的细胞与阴性对照相比，其p55PIK的mRNA水平和蛋白水平均有明显的升高。见图2。

A：各组p55PIK mRNA表达水平；B：各组p55PIK蛋白表达水平；与对照组比较，**P<0.01图2　p55PIK高表达稳定细胞系的鉴定Fig.2 Identification of stable cell lines with high expression of p55PIK

2.3p55PIK对LoVo细胞周期及DNA合成的影响

将p55PIK稳定高表达的LoVo细胞和阴性对照细胞正常培养，待细胞生长至80%左右融合度时，通过BrdU/PI法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响。结果显示：阴性对照组处于DNA合成期的细胞占总体百分比为(28.62±1.87)%，高表达p55PIK组为(43.25±2.18)%；阴性对照组处于S期的细胞占总体百分比为(29.90±1.98)%，高表达组为(41.08±2.59)%，提示：高表达p55PIK能够促进LoVo细胞DNA的合成，并能使细胞富集于S周期。见图3。

2.4高表达p55PIK对p-Akt的影响

进一步，我们通过Western blot方法检测了高表达p55PIK对经典的PI3K/Akt信号通路的影响。细胞生长至对数期，收集细胞，并裂解细胞总蛋白，通过Western blot方法检测了p-Akt、Akt、p55PIK、GAPDH的表达。结果显示：在p55PIK高表达的细胞中，p55PIK的表达明显升高；但是，相应的p-Akt的表达却没有明显的变化，见图4。结果说明p55PIK促进细胞DNA的合成及细胞周期的进程并不依赖于经典的PI3K/Akt信号通路。

3讨论

PI3K/Akt介导的信号通路在结直肠癌的发生和发展过程中发挥着重要作用[9]。p55PIK(由PIK3R3基因编码)是PI3K调节亚基之一，我们前期研究发现p55PIK在结直肠癌中呈高表达状态，高表达p55PIK能够促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭迁移和血管生成，进一步，我们发现，p55PIK发挥上述功能并非依赖经典的PI3K/Akt信号通路[10-12]。为了进一步探索p55PIK在结直肠癌细胞中的功能和具体机制，我们构建了p55PIK高表达的质粒，并筛选了p55PIK稳定高表达的结直肠癌LoVo细胞，通过实验证明了p55PIK能够稳定高表达，为进一步的实验提供了良好的实验工具。

A :BrdU/PI掺入法检测各组细胞DNA的合成；B：细胞周期分布图3　高表达p55PIK对LoVo细胞DNA合成和细胞周期的影响Fig.3 Effect of over-expression of p55PIK on DNA incorporation and cell cycle of LoVo cells

图4　Western blot法检测细胞中p55PIK和p-Akt的表达Fig.4 Western blot analysis of the expression of p55PIK and p-Akt in two groups

1995年，Pons等[13]首次报道了p55PIK为PI3K调节亚基之一。随后，Xia 等[8]发现p55PIK与其他调节亚基的不同在于其N末端从线虫到人类均高度保守的特异性的24个氨基酸，并进一步证明了其N端24个氨基酸能够与视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)结合，促进后者磷酸化，导致细胞周期的改变，针对p55PIK的特异性抑制剂N24能够有效地阻滞细胞周期，抑制细胞增殖。有研究表明，p55PIK与多种肿瘤的发生和发展相关，其中在卵巢癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和胃癌中呈明显高表达状态，与这些肿瘤的发生发展密切相关[6-7]。我们最新研究发现p55PIK能够与细胞核增殖抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)直接结合，促进细胞的增殖，导致肿瘤的发生。这些均提示p55PIK在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，针对p55PIK的特异性抑制剂有可能为肿瘤的治疗提供新的、有效的靶点[10,14]。

我们在成功构建的p55PIK稳定高表达的LoVo细胞中，检测了其对细胞DNA合成和细胞周期的影响，结果发现高表达p55PIK能够明显促进LoVo细胞DNA的合成和细胞S期的富集，这提示p55PIK能够促进LoVo细胞的增殖，而且，我们还发现，高表达p55PIK并不影响LoVo细胞p-Akt的水平，这提示其促进细胞DNA合成和S期的进程不是通过经典的Akt信号通路，为我们的下一步机制研究提供了初步线索。

参考文献

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(2015-08-27收稿)

Establishment of p55PIK High-expression Cell Line and Its Effects on Cell Cycle of LoVo Cells

Cao Xiaonian1，Hu Fayong2，Yang Xi3etal

1DepartmentofThoracicSurgery，2CancerResearchInstitute，3DepartmentofGastrointestinalSurgery，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo construct the p55PIK high-expression plasmid，screen out LoVo cell line with stable high-expression of p55PIK，and examine the effect of p55PIK on cell cycle of LoVo cells.MethodsTarget fragment was amplified by polymerase chain reaction(PCR)，with the genomic cDNA as the template，and then cloned into the pcDNA3.1 vector by using restriction endonuclease and T4 DNA ligase.LoVo cells were transfected with pcDNA3.1-p55PIK vector and then G418(500 μg/mL)was added to identify stable overexpressed p55PIK cell line.Real-time quantative PCR and Western blot were used to detect the mRNA and expression levels of p55PIK.Furthermore，the effect of p55PIK on cell cycle progression and DNA synthesis was examined by BrdU/PI incorporation method.Resultsp55PIK high-expression vector was successfully constructed and LoVo cells with stable high-expression of p55PIK screened out.Over-expressed p55PIK in LoVo cells could promote cell cycle progression in S phase and DNA incorporation in LoVo cells.ConclusionStable LoVo cell line with p55PIK high expression was successfully obtained.Overexpressing p55PIK could promote cell cycle progress in S phase and DNA incorporation in the cells.

Key wordsp55PIK；stable cell line；LoVo cell line；cell cycle；DNA incorporation

中图分类号：R735.35

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.002

*国家自然科学基金资助项目(No.81301899，81372662)

曹小年，男，1984年生，博士研究生，E-mail：caoxiaonian@aliyun.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jbhu@tjh.tjmu.edu.cn