B7-H1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

黎　靖　陈　红　雷正明　付文广　淦　宇　蒋　禹　温　剑　李　秋　李　波

(泸州医学院附属医院肝胆外科，四川　泸州　646000)



B7-H1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

黎靖陈红雷正明付文广淦宇蒋禹温剑李秋李波

(泸州医学院附属医院肝胆外科，四川泸州646000)

〔摘要〕目的探讨B7-H1在人肝癌组织中的表达情况及其对肝癌HepG2细胞增殖能力和凋亡水平的影响。方法采用组织化学染色方法观察肝癌组织和癌旁正常组织中B7-H1的表达情况。采用Lonza电转染的方法转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2进入肝癌HepG2细胞，并通过RT-PCR和Weatern印迹方法检测肝癌HepG2细胞中B7-H1的表达情况。敲低肝癌HepG2细胞中B7-H1的表达后，采用MTT方法检测肝癌HepG2细胞的增殖情况，并采用Annexin V/7-AAD双染的方法检测肝癌HepG2细胞的凋亡水平。结果与癌旁正常组织相比，肝癌组织中B7-H1的表达水平显著升高。采用Lonza电转染的方法转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2进入肝癌HepG2细胞后，肝癌HepG2细胞中-B7-H1的表达水平均显著降低。转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2细胞中B7-H1表达后，肝癌HepG2细胞的增殖能力均显著降低，与对照组相比差异显著(P<0.01)。转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2细胞中B7-H1表达后，肝癌HepG2细胞的凋亡均显著升高，与对照组相比差异显著(P<0.01)。结论肝癌组织中B7-H1的表达水平显著升高，且B7-H1可促进肝癌HepG2细胞的增殖能力，并抑制肝癌HepG2细胞的凋亡水平，提示肝癌组织中高表达的B7-H1与肝癌的发生和发展密切相关。

〔关键词〕肝癌；B7-H1；增殖；凋亡

B7-H1(B7 homolog 1)是B7家族的第三个成员，又称为程序性死亡配体(PD-L1)。B7-H1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞〔1，2〕。近年来的研究发现，B7-H1具有促进肿瘤进展的功能，且在多种肿瘤细胞均存在B7-H1不同程度的表达上调〔3，4〕。而关于B7-H1在肝癌组织的表达及其对肝癌细胞增殖和凋亡能力的影响目前研究还不是很多，本研究旨在观察B7-H1对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1临床资料选取2013 年12月1日至2014 年12月01日在我科住院并行手术治疗的肝癌患者50例。患者术前均未接受化学治疗、放射治疗或免疫治疗，收取患者癌组织标本，同时收集50例患者癌旁组织标本作为对照。组织标本离体后10 min内冻存于液氮中保存。每例样本均经过组织病理学诊断证实为肝癌，癌旁组织亦均经过组织病理学诊断证实未见肿瘤进入。患者的平均年龄(58.1±17.1)岁。

1.2细胞及主要试剂人肝癌细胞系HepG2购自中国医学科学院基础医学研究所，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG及免疫组织化学染色试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司；转染试剂购自Lonza公司；si-B7-H1-1和si-B7-H1-2购自Invitrogen公司；B7-H1和Actin抗体购自Santa Cruz公司；Annexin V/7-AAD染色试剂盒购自Biolegend公司。

1.3免疫组织化学染色方法标本采用甲醛固定、石蜡包埋的组织进行，具体操作方法参见文献报道〔5〕。

1.4电穿孔转染法严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5Western印迹肝癌HepG2细胞总蛋白经10% SDS-PAGE 分离胶和5%浓缩胶分离后，通过半干转膜仪将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜随后采用含5% BSA 的TBST室温孵育封闭2 h，于适量封闭液加入鼠抗人p-Smad2和p-Erk1/2抗体，4℃过夜孵育。次日以0.1% TBST 洗涤硝酸纤维素膜3次，5 min/次，加入相应种属的HRP标记二抗，室温孵育1 h。0.1% TBST 子弟硝酸纤维素膜后，采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。β-actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。

1.6MTT方法检测细胞增殖能力肝癌HepG2细胞培养至对数生长期，接种于96孔培养板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150 μl的DMSO溶液，低速震荡10 min后，波长490 nm处测定OD值。

1.7凋亡染色方法严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.8统计学方法采用SPSS16.0软件进行t检验。

2结果

2.1B7-H1在肝癌组织中的表达情况免疫组织化学染色结果显示，癌旁正常组织仅6例(12.0%)为B7-H1染色阳性；而肝癌组织有24例(48.0%)。肝癌组织B7-H1表达水平与癌旁正常组织相比显著升高。见图1。

图1　肝癌组织B7-H1免疫组织化学染色结果(×100)

2.2B7-H1在肝癌HepG2细胞中的表达情况转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2可显著降低肝癌HepG2细胞中B7-H1的mRNA表达水平(分别为0.38±0.06，0.48±0.09)，parental组为1.00±0.39，si-control组为1.14±0.43；同时，转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2亦可显著降低肝癌HepG2细胞中B7-H1的蛋白表达水平。见图2。

图2　敲低B7-H1在肝癌HepG2细胞中的表达效果检测

2.3B7-H1对肝癌HepG2细胞增殖能力的影响如图3所示，转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2细胞中B7-H1表达后，肝癌HepG2细胞的增殖能力均显著降低，与对照组相比差异显著(P<0.01)。

2.4B7-H1对肝癌HepG2细胞凋亡水平的影响转染si-B7-H1-1和si-B7-H1-2敲低肝癌HepG2细胞中B7-H1表达后，肝癌HepG2细胞的凋亡均显著升高〔分别为(14.13±4.13)%，(13.65±3.87)%〕，与对照组〔parental组为(6.94±1.86)%，si-control组为(7.08±1.74)%〕相比差异显著(P<0.01)。

图3　B7-H1对肝癌HepG2细胞增殖能力的影响

3讨论

免疫共刺激分子B7-H1(又称为CD274)是新近发现的程序性死亡共抑制受体(PD-1)(又称为CD279)的配体分子〔6〕。细胞被激活或在有IFN-α存在的条件下，B7-H1的表达可出现上调。除外表达于淋巴细胞，在心脏血管内皮细胞、微血管内皮细胞、胰岛和胎盘组织中也检测到低水平的B7-H1表达〔7〕。正常情况下，表达于抗原提呈细胞表面的B7-H1可通过于T细胞表面的PD-1相结合，而在诱导和维持免疫耐受中发挥重要作用。

近年来研究发现，B7-H1分子不仅表达于淋巴细胞和正常组织中，在恶性肿瘤中也有表达，包括肺、食道、头颈部鳞癌以及其他类型的肿瘤，如乳腺癌、黑素瘤、胶质瘤、卵巢癌、膀胱鳞状细胞癌〔8〕。肿瘤组织中表达的B7-H1分子与肿瘤预后不良密切相关，且与肿瘤恶性程度相关。动物实验结果显示，阻断B7-H1的作用可加速肿瘤的消退〔9，10〕。肿瘤相关的B7-H1具有诱导细胞毒性T细胞(CTL)凋亡的作用，从而使得肿瘤科从T细胞介导的免疫监视作用中逃逸〔11〕。关于B7-H1在肿瘤发生发展中的作用研究还处于初期阶段。Dong等〔11〕研究发现，在正常的结肠组织中不存在B7-H1的表达，而在恶性程度较高的结直肠癌组织中可检测到B7-H1的表达。同时，Shi等〔8〕研究发现B7-H1的表达与结直肠癌的预后不良密切相关，同时具有调节结直肠癌细胞增殖和侵袭的功能。

本研究结果显示，在肝癌组织中B7-H1的表达水平显著升高；同时，B7-H1具有存进肝癌细胞增殖，并抑制肝癌细胞凋亡的作用，提示肝癌组织中高表达的B7-H1与肝癌的发生和发展密切相关。

4参考文献

1Yan Z，Zhuansun Y，Liu G，etal.Mesenchymal stem cells suppress T cells by inducing apoptosis and through PD-1/B7-H1 interactions〔J〕.Immunol Lett，2014；162(1 Pt A)：248-55.

2Wang H，Qi F，Dai X，etal.Requirement of B7-H1 in mesenchymal stem cells for immune tolerance to cardiac allografts in combination therapy with rapamycin〔J〕.Transpl Immunol，2014；31(2)：65-74.

3Jang IK，Lee JH，Yoon HH，etal.Suppression of T-cell proliferation by and B7-H1 expression on human liver-derived stem cells〔J〕.Transplant Proc，2015；47(3)：784-6.

4Yang Y，Wu KE，Zhao E，etal.B7-H1 enhances proliferation ability of gastric cancer stem-like cells as a receptor〔J〕.Oncol Lett，2015；9(4)：1833-8.

5Quan Y，Xu M，Cui P，etal.Grainyhead-like 2 promotes tumor growth and is associated with poor prognosis in colorectal cancer〔J〕.J Cancer，2015；6(4)：342-50.

6Dong H，Zhu G，Tamada K，etal.B7-H1，a third member of the B7 family，co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion〔J〕.Nat Med，1999；5(12)：1365-9.

7Eppihimer MJ，Gunn J，Freeman GJ，etal.Expression and regulation of the PD-L1 immunoinhibitory molecule on microvascular endothelial cells〔J〕.Microcirculation，2002；9(2)：133-45.

8Shi SJ，Wang LJ，Wang GD，etal.B7-H1 expression is associated with poor prognosis in colorectal carcinoma and regulates the proliferation and invasion of HCT116 colorectal cancer cells〔J〕.PLoS One，2013；8(10)：e76012.

9Hirano F，Kaneko K，Tamura H，etal.Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity〔J〕.Cancer Res，2005；65(3)：1089-96.

10Keir ME，Butte MJ，Freeman GJ，etal.PD-1 and its ligands in tolerance and immunity〔J〕.Annu Rev Immunol，2008；26：677-704.

11Dong H，Strome SE，Salomao DR，etal.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion〔J〕.Nat Med，2002；8(8)：793-800.

〔2015-08-17修回〕

(编辑滕欣航)

〔中图分类号〕R735

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1832-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.018

基金项目：四川省卫计委项目(140030)

第一作者：黎靖(1970-)，男，副主任医师，主要从事肝胆胰疾病基础和临床方向研究。