半干旱黄土区蓝藻液体培养条件研究

马淑敏，法　蕾，孙长忠，辛学兵

(中国林业科学研究院华北林业实验中心，北京 102300)



半干旱黄土区蓝藻液体培养条件研究

马淑敏，法蕾，孙长忠，辛学兵*

(中国林业科学研究院华北林业实验中心，北京 102300)

摘要：以半干旱黄土区藻类结皮中的蓝藻为研究对象，对其室内液体培养所需营养、光照及温度条件进行研究，揭示不同条件下蓝藻生长的规律。结果表明：N、P浓度不同藻种生长情况不同，N10、P1浓度下藻种生物量最大；不同光照时间对比研究发现，光照12h藻种生长稳定，而且生物量高峰值最大，长时间光照16h繁殖快衰亡也快，生长不稳定；温度也是影响藻种生长的重要条件，15℃、室温和20℃时，藻种生长均比较稳定，但15℃藻种生物量一直比较低，35℃条件下，藻种生长不稳定。

关键词：黄土高原；蓝藻结皮；生物量；液体培养

我国干旱、半干旱地区面积占总国土总面积1/2[1]，黄土高原区作为水土流失和生态环境破坏最严重的地区之一，因其水分养分匮乏，生态环境脆弱，生态环境治理是一项艰巨而重要的任务[2-6]。在干旱、半干旱地区，70%以上的范围覆盖着生物结皮[7-8]，土壤生物结皮是由细菌、真菌、藻类、地衣和苔藓等形成的一种混合体[9]，在我国西部和北部地区有着广泛的分布[10]，其中藻结皮是生物结皮的主要组成部分，藻类结皮是指生长在于旱、半干旱地区的藻类与其下层很薄的土壤共同形成的一个复合的生物土壤层[11]，藻类作为先锋生物，常在条件恶劣的环境下生存，并影响改变着周围环境[10，12-13]。

蓝藻结皮在藻结皮中占据重要地位，在干旱和半干旱地区广泛分布，蓝藻结皮中的大量丝状蓝藻形成胶鞘和分泌蓝藻细胞胞外多糖[14]，丝状蓝藻和其分泌的胞外多糖起着捆绑、黏结沙粒和固定沙粒的作用，最终产生减少水蚀和风蚀的生态效应，蓝藻在藻结皮的形成及藻结皮演替中都具有重要作用[15]。

鉴于藻类结皮对半干旱黄土区水土保持的重要意义，许永霞等[16]对人工培养藻结皮的环境条件进行了研究，而藻种来源则成为人工培育藻结皮的首要条件。藻类生物量的影响因子包括水分、光照、PH值、温度及养分等等，各因子间的交互作用使得生物量对各因子的反应效果不同[12，17-18]。 例如，低温光照明显抑制蓝藻结皮活性，而低温黑暗却能促进蓝藻活性和形态恢复[19]，藻生长需要光照，但是紫外辐射过强会影响藻结皮的生产力[20]。研究蓝藻室内水培条件具有重要意义，为大批量生产藻种提供技术基础，进而为人工野外反接培育人工藻结皮治理黄土区水土流失提供丰富的藻种资源。

1材料与方法

1.1藻种

把在半干旱黄土高原区采集土壤藻类结皮，装入塑料袋中，带回室内分离蓝藻并纯化，用小罐头瓶进行液体培养。

1.2培养基

选用BG-11培养基配方，主要成份为：NaNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，Na2CO3，柠檬酸，柠檬酸铁，EDTANa2，微量元素溶液A5。

1.3培养方法

将培养蓝藻用的罐头瓶洗净，然后倒入配置好的BG-11培养基，每瓶约60 mL，用封口膜封口，在121℃高压下灭菌20 min.。收集已分离培养的生长状况良好的蓝藻，破碎25 min，搅匀后用移液枪取10 mL接种到罐头瓶中进行培养，蓝藻培养过程中每天进行手动震荡摇匀。

1.4试验设计

1.4.1 营养成分含量试验 在BG-11培养基基本养分含量及室内室温且自然光条件下进行。每个处理设90个样，连续监测30 d，每天取样3个(即3个重复)进行测定。

(1) N元素含量试验： K2HPO4含量(即P含量)不变，设置加入150 g·L-1NaNO3共4个处理，即0、5、10、20 mL。

(2)P元素含量试验：NaNO3含量(即N含量)不变，设置加入40 g·L-1K2HPO4共4个处理，即0、1、2、5 mL。

1.4.2光照时间试验在BG-11培养基基本养分含量及室温室内培养架上进行，采用日光灯照射，每个培养架上安装光照时间分控器；试验监测45 d，进行18次取样测定；光照时间设3个处理，即16、12、8 h。

1.4.3温度控制试验在BG-11培养基基本养分含量、室内自然光照条件下，培养箱中进行；监测45 d，进行18次取样测定；温度设4个处理，即15℃、20℃、室温(27℃左右)、35℃。

1.5测定方法

藻种生物量用UV-2600型紫外可见分光光度计680 nm波长测定吸光度值，绘制生长曲线。具体测定方法见文献[21]。

1.6数据处理

数据统计与相关性分析采用Excel2007和SPSS16.0分析软件。

2试验结果

2.1不同营养条件对蓝藻生长的影响

藻类的生长与培养液的营养条件密切相关，N、P是影响藻种繁殖的两大主要营养成分。通过研究发现，在培养基成分N或P浓度为0的情况下蓝藻生长停滞，3～5 d时间藻种全部变黄死亡；藻类的繁殖速度与浓度和时间呈现明显的相关关系，其余各组分，各浓度藻种在生长到10～14 d左右时，增长速度最快，且均在15 d左右达到高峰值，然后进入平稳生长时期，在约18 d左右开始平缓下降，逐渐衰亡，这一过程比较缓慢(图1、图2)。

由图1可以看出，P1含量不变的情况下，N营养各浓度梯度下藻种生物量高峰值不同。N10浓度藻种生物量高峰值最大，分别比N5、N20高出97.07%和96.95%，经方差分析，N10浓度下藻种繁殖高峰期生物量与N5、N20浓度藻种繁殖高峰期生物量有极显著差异(p<0.01)；由图2可见，N10含量不变的情况下，P2浓度下藻种生物量的高峰值与P5浓度下藻种生物量的高峰值有极显著差异(p<0.01)。通过图1 、图2对比分析， 配方N10P1与N10P2相比较，N10P1藻种生物量最大值极显著高于N10P2藻种生物量最大值(p<0.01)，可以得出，最合适的营养比例为N10P1配方。

2.2不同光照时间对蓝藻生长的影响

光照是影响藻类生长的重要环境条件之一。由图3可见，光照时间16 h的藻种生物量在第4 d时达到最大，当藻种生长到第11 d时，生物量大幅下降,随后开始平缓生长且逐渐衰亡，而光照12 h和8 h的藻种前期生长比较缓慢，生物量均在15 d左右达到高峰，由此表明，在藻类培养初期，持续而充足的光照有利于藻类的快速繁殖。通过方差分析，光照时间12 h的藻种生物量高峰值与8 h、16 h光照的藻种生物量高峰值均有极显著差异(p<0.01)；光照时间12 h的蓝藻生物量在第18 d左右大幅下降，随后进入平缓生长期，光照时间8 h的蓝藻整个生长过程都平缓，由此表明，藻类培养后期，适当减弱光照反而有利于藻种培养时间的延长，因为藻类繁殖早期，需要大量光照进行光合作用，而后期，由于培养基养分消耗殆尽，减弱光照，就可以减慢藻类的生长速度，减缓藻类的死亡。

图1　N含量不变条件下不同P浓度蓝藻生长曲线

图2　P含量不变条件下不同N浓度蓝藻生长曲线

2.3不同温度水平对蓝藻生长的影响

温度也是影响藻类生长的一个重要环境条件。研究表明(图4)，在高温35℃条件下藻种前期繁殖最快，生长到第3 d时，生物量是其它温度水平的3倍多，第7 d生物量即达到高峰值，之后,进入10 d左右的波动期，到第21 d前后生物学大幅下降。由此可见，高温条件下，藻种繁殖快衰亡也快；室温下，藻种平缓生长至第18 d左右生物量达到高峰值，而且一直持续到第27 d左右才开始大幅度下降，藻种的快速繁殖期时间最长，随后平缓生长逐渐衰亡，说明室温是最利于藻种生长的温度条件；20℃条件下蓝藻在21 d左右生物量最大，比室温下藻种生物量最大值低24.9%，随后生物量大幅下降；15℃条件下藻种一直平稳缓慢生长，没有出现藻种大量繁殖的现象，表明温度过低不利于藻种的生长。

图3　不同光照时间下蓝藻生长曲线

图4　不同温度条件下蓝藻生长曲线

3结论与讨论

本研究从野外藻类结皮中分离出蓝藻并进行室内液体培养，在藻种生长繁殖环境发生巨大变化，藻种液体培养适应期后，收集生长状况良好的藻种,再转接到不同营养条件的液体培养基培养和光谱条件下试验,结果为营养条件不同与藻类繁殖生长呈现明显的相关关系:N、P、K作为藻类生长重要的营养成分，当N、P含量不同时，藻种的生长繁殖受到很大影响，在N10P1营养配方下藻种的生物量显著高于其它营养配方，说明藻种的繁殖不仅需要营养，而且各养分还需保持合适的浓度比例，才会实现藻种的快速繁殖和大量繁殖；光照时间不同，藻种生长呈现不同的规律，光照12 h的藻种生长情况最好，最长光照16 h的藻种繁殖速度快但衰亡也最快，由此说明，藻类生长初期，充足的光照有利于藻类的快速繁殖，而中后期减少光照反而有利于藻种生长时间的延长，原因可能是藻类繁殖早期，需要大量光照进行光合作用，而到了中后期，随着培养基养分的消耗，减弱光照，可以减慢藻类的生长速度，从而减缓藻类的死亡；不同温度水平影响藻种的生长繁殖，20℃和室温下藻种生长稳定，室温下藻种繁殖更多，温度过高(35℃)藻种快速繁殖，但也加快了藻种的死亡，温度过低(15℃)，蓝藻生长情况较稳定，但生物量较低，可能低温在一定程度上抑制了藻种生长，不利于藻种的繁殖。

蓝藻室内液体的培养，控制好藻种生长所需的营养、温度、光照等环境条件非常重要，以此可以为今后用大桶、大池子人工培养繁殖大批量藻种奠定一定基础，进而提供野外人工培养藻结皮治理黄土区水土流失所需的藻种资源。关于人工培养蓝藻今后仍需要进行深入研究，比如：藻种生长繁殖与生长时间的相关性，因为研究发现，不同环境条件下，藻种繁殖速度、繁殖的量以及衰亡时间都有所不同，通过何种手段控制藻种衰亡，延长繁殖时间或是恢复其活性，都需要深入地研究。

参 考 文 献

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Liquid Culture Conditions of Cyanobacteria in Semi-arid Region of Loess Plateau

MA Shu-min1，FA Lei1，SUN Chang-zhong1

(1.NorthExperimentalCenterofForestry,CAF,Beijing102300)

Abstract:Cyanobacteria of algal crust in semi-arid region of Loess Plateau as object,its liquid culture conditions regarding nutrition,illumination strength and temperature were studied to reveal the influence of different conditions on algae growth. The results showed that N and P concentrations influenced the growth of algae. The biomass of algae was maximum under the N10 and P1 treatments. The algae grew stably under the 12 hours light and the biomass peak is maximum. The algae grew unstably under 16 hours light，propagated and degradedly quickly. The temperature is an important condition influencing the growth of algae. The algae grew stably at the 15℃,20℃and the room temperatures,but the biomass of algae was low at 15℃.

Key words:Loess Plateau; cyanobacterial crusts; biomass; liquid culture

中图分类号:Q949.22

文献标识码:A

文章编号:1001-2117(2016)02-0001-04

作者简介：马淑敏(1981-)，女，汉，山东德州人，硕士，工程师，主要从事土壤生态学研究。

基金项目：“十二五”国家科技支撑项目(2015BAD07B0202)。

收稿日期：2015-07-18