无乳链球菌VicRK双组分信号转导系统的功能预测

郭桂英 徐圣杰 徐港 侯国峰 蒲文渊 杨诺 曾纪峰 郑继平

摘 要 VicRK可调控细胞壁代谢，是部分低G+C值革兰氏阳性菌中最为关键的双组分信号转导系统。为预测该系统在无乳链球菌中的具体功能，依据VicR蛋白与调控基因启动子结合的17 bp保守基序，采用perl语言编写生物信息学软件，对中国鱼源无乳链球菌GD201008-001全基因组进行双向探查。结果显示，在该基因组中，oppA、deoR、acpP、NPD、cas9和pcsB等11个基因启动子中存在VicR结合位点，通过结合各基因的生物学功能进行预测可知，VicRK双组分信号转导系统在无乳链球菌中可能具有调节渗透压、脂肪酸代谢和细胞壁代谢等功能，同时具有参与细菌免疫和细菌毒力等重要作用。

关键词 无乳链球菌 ；双组分信号转导系统 ；VicRK ；保守基序 ；生物信息学

中图分类号 S182

Abstract VicRK is a conserved and important two component system in low G+C gram-positive bacteria，which controls the cell wall metabolism. To predict the specific functions of VicRK in Streptococcus agalactiae（SA），a computer program was written by using the perl computer language. All the sited of the conserved 17 bp VicR binding motif in the SA strain GD201008-001were dig out by whole-genome screening，and 11 sites were found in different promoters. Combining the function of the downstream genes which were oppA， deoR， acpP， NPD， cas9 and pcsB etc，it was speculated that VicRK would take a role in control of osmotic pressure，metabolism of fatty acid and cell wall，regulation of immunity and virulence in Streptococcus agalactiae.

Key words Streptococcus agalactiae ；two component system ；VicRK ；conserved motif ； bioinformatics

双组分信号转导系统（two-component signal transduction system，TCS）是细菌积极应对外界多变环境、维持自身有效存活的信号传递系统，该系统由跨膜的组氨酸蛋白激酶（histidine kinase，HK）和胞内的反应调控蛋白（response regulator，RR）组成，HK和RR通过磷酸化和去磷酸化调节细胞的信号传递，并通过RR与特异启动子的结合，调控对应靶基因的表达，实现细胞对外界环境变化的实时应答。VicRK是广泛存在于低G+C值革兰氏阳性菌中的高度保守的双组分信号转导系统，该系统调控细胞壁的代谢平衡，对细胞存活具有决定性作用，是防治致病菌的理想靶标[1]，其中VicR为胞内RR，VicK为跨膜HK。已有研究表明，A群链球菌的VicRK非条件突变菌株具有明显的弱毒活性[2]，已作为弱毒疫苗正在研发。

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，SA）或称 B群链球菌（Group B Streptococcus，GBS），可引起人类以及多种陆生和水生生物产生脑膜炎、肺炎和败血症等多种疾病，具有较高的致病和致死率。由于没有有效的防治手段，近年来，水产无乳链球菌病害频繁爆发，并以罗非鱼无链球菌病害最为严重[3]，直接影响到中国作为罗非鱼第一生产大国的地位。因此，急需加强该菌的防治措施。基于VicRK在细胞壁代谢中的关键作用及其在疫苗开发中的重要价值，笔者对其在无乳链球菌中的功能进行了探究。

目前，VicRK在无乳链球菌的具体作用与功能尚无相关报道，为此，本研究依据枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌中VicRK结合位点的保守基序，设计生物信息学软件，对无乳链球菌的全基因组进行双向筛查，获取并分析该菌中VicRK的调控基因，进而预测此双组分转导系统在无乳链球菌的调控功能，为进一步利用该系统开发弱毒疫苗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Genbank序列数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；perl语言程序（http：//www.perl.org/）

1.2 方法

1.2.1 保守基序全基因组双向查询软件设计

从Perl官网（http：//www.perl.org/）下载相应版本。首先下载和安装Windows（x86）Active State Perl程序，继而从notepad官网下载和安装与本地电脑相配的版本；在windows32操作系统下，依据基因组DNA双链结构特点，编写具有双向查询特定序列功能的formatedb.pl和promoter_search.pl语言程序。

1.2.2 搜索数据库的构建

从NCBI Genome database上检索无乳链球菌基因组序列，下载鱼源无乳链球菌GD201008-001菌株全长基因组的genebank（full）格式与fastag格式，并将其命名为对应的sequence.fasta和sequence.gb 2个文件，将其放置于上步编写程序的同一文件夹中；双击formatedb.pl程序自动读取sequence.fasta和sequence.gb 2文件，最后在bin文件下自动生成相关的3个数据库（fcis_element.sum、forward.sum和genebank2.db）。

1.2.3 VicRK全基因组结合位点查寻

双击打开promoter_search.pl程序，输入修改后的VicRK结合位点保守基序TGTWAH-N5-WGTWAH（W：A＼T，R：A＼G，H：A＼T＼C，N：A＼T＼C＼G），按下ENTER键运行程序，然后按Ctrl+D，接着按ENTER键开始搜索；搜索结束后，自动生成一个key_sequence文件夹，其中有4个子文件，分别为：0fasta_p.fa、0id_gene_p.fa、0sum_Promoter.xls和0ther_result_p.out。其中0fasta_p.fa是查询的保守基序fasta的格式列表；0id_gene_p.fa是保守基序所对应的下游基因列表信息，包括基因ID在基因组中的位置，保守基序与下游基因的距离等；0sum_Promoter.xls是保守基序所对应的下游基因全部信息列表；other_result_p.out是除上述文件列出之外的其他相关信息列表。

1.2.4 VicRK功能预测

分析key_sequence输出信息，筛查出存在于启动子上的保守基序，获取这些启动子所对应的基因功能，进而预测VicRK在无乳链球菌中可能的调控作用。

2 结果与分析

2.1 保守基序搜索软件的编写

采用Perl语言所编写的KSS（Key sequence search）软件大小为6 MB，包含的文件有0fasta_p.fa、0id_gene_p.fa、0sum_Promoter.xls、0ther_result_p.out、formatedb.pl、promoter_search.pl、sequence.fasta、sequence.gb和一个bin文件，其中bin中含有keysequence.pl、sequence.pl、forward.pl、reverse.pl、annotation.pl、fcis_element_sum、forward.sum、genbank.db等8个子文件。KSS核心代码如下。

#！/usr/bin/perl

open OUT1， ">key-sequence.txt"；

print'my $R =（A，G）；

my $Y=（C，T）；

my $M=（A，C）；

my $W=（A，T）；

my $K=（G，T）；

my $S=（C，G）；

my $B=（C，G，T）；

my $V=（A，C，G）；

my $D=（A，G，T）；

my $H=（A，C，T）；

my $N=（A，T，G，C）'；

print"＼nplease，entry your sequence，and press ENTER to end.＼n"；

my $sequence=；

chop（$sequence）；

print"the resoult are：＼n"；

my $sequencef=$sequence；

$revcom=reverse $sequence；

# See the text for a discussion of tr///

$sequencef=～tr/ACGTRYMKSWHDBVacgtrymkswhdbvn/ACGTRYMKSWHDBVACGTRYMKSWHDBVN/；

$revcom=～tr/ACGTRYMKSWHDBVacgtrymkswhdbvn/TGCAYRKMWSDHVBTGCAYRKMWSDHVBN/；

print"$sequencef＼n"；

print"$revcom＼n"；

print OUT"$sequencef＼n"；

print OUT"$revcom＼n"；

my $sequencef_save=$sequencef；

$_=$sequencef_save；

s/A/[$A]/gi；

s/T/[$T]/gi；

s/G/[$G]/gi；

s/C/[$C]/gi；

s/R/[$R]/gi；

s/M/[$M]/gi；

s/K/[$K]/gi；

s/S/[$S]/gi；

s/W/[$W]/gi；

s/H/[$H]/gi；

s/D/[$D]/gi；

s/B/[$B]/gi；

s/V/[$V]/gi；

s/Y/[$Y]/gi；

s/N/[$N]/gi；

$sequencef_save=$_ ；

print"the forword key-sequence are：＼n" .$sequencef_save."＼n"；

print OUT1"the forword key-sequence are：＼n".$sequencef_save ."＼n"；

my $revcom_save=$revcom；

$_=$revcom_save；

s/A/[＼$A]/gi；

s/T/[＼$T]/gi；

s/G/[＼$G]/gi；

s/C/[＼$C]/gi；

s/R/[＼$R]/gi；

s/M/[＼$M]/gi；

s/K/[＼$K]/gi；

s/S/[＼$S]/gi；

s/W/[＼$W]/gi；

s/H/[＼$H]/gi；

s/D/[＼$D]/gi；

s/B/[＼$B]/gi；

s/V/[＼$V]/gi；

s/Y/[＼$Y]/gi；

s/N/[＼$N]/gi；

$revcom_save=$_；

print"the revers key-sequence are：＼n" .$revcom_save ."＼n"；

print OUT1"the reverse key-sequence are：＼n".$revcom_save ."＼n"；

open OUT2，">dealed-with-file.txt"；

my $sequence；

open SEQUENCE ，"while（

VicRK高度保守，在枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌中，其结合位点序列也存在一定的保守性，最为保守的部分为TGTWAH-N5-TGTWAH（W：A＼T，R：A＼G，H：A＼T＼C，N：A＼T＼C＼G）[4-5]；但在变异链球菌中，VicRK的保守基序有少许变化，为TGTWAHA-N4-TGTWAHA[6]。在本研究中，为能够更有效地预测VicRK在无乳链球菌中可能的结合位点，笔者对VicRK的调控基因PcsB基因[7]的上游序列进行了先行分析，结果发现，在无乳链球菌和变异链球菌中，该基因的上游64 bp处，除一个碱基外，都存在一个近乎完全符合TGTWAH-N5-TGTWAH的保守序列。因此，笔者采用微调的TGTWAH-N5-YGTWAH序列，通过KSS设计软件，对VicRK在无乳链球菌基因组中可能存在的结合位点进行预测。

通过预测发现，在无乳链球菌GD201008-001中，VicRK可能存在11个结合位点，对应的基因包括细胞壁代谢基因、毒力基因、自身免疫基因、物质转运基因、脂肪酸合成基因、营养代谢基因和蛋白翻译基因等，由此预测，VicRK通过调控这些基因的表达来参与相关生物学活性的调节。但是在无乳链球菌中，VicRK是否真的具有以上的结合位点，仍需要通过进一步的实质性验证才能证实。

参考文献

[1] Dubrac S，Bisicchia P，Devine K M，et al. A matter of life and death：cell wall homeostasis and the WalKR（YycGF）essential signal transduction pathway[J]. Mol Microbiol，2008，70（6）：1 307-1 322.

[2] Liu M，Hanks T S，Zhang J，et al. Defects in ex vivo and in vivo growth and sensitivity to osmotic stress of group A Streptococcus caused by interruption of response regulator gene vicR[J]. Microbiology，2006，152（4）：967-978.

[3] 郭玉娟，张德锋，樊海平，等. 中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究[J]. 水产学报，2012，36（3）：399-406.

[4] Dubrac S，Msadek T. Identification of genes controlled by the essential YycG/YycF two-component system of Staphylococcus aureus[J]. J Bacteriol， 2004，186（4）：1 175-1 181.

[5] Echenique J R，Trombe M C. Competence repression under oxygen limitation through the two-component MicAB signal transducing system in Streptococcus pneumoniae and involvement of the PAS domain of MicB[J]. J Bacteriol，2001，183（15）：4 599-4 608.

[6] Ayala E，Downey J S，Mashburn-Warren L，et al. A biochemical characterization of the DNA binding activity of the response regulator VicR from Streptococcus mutans[J]. PLoS One，2014，9（9）：e108 027.

[7] Ng W L，Robertson G T，Kazmierczak K M，et al. Constitutive expression of PcsB suppresses the requirement for the essential VicR（YycF）response regulator in Streptococcus pneumoniae R6[J]. Mol Microbiol，2003，50（5）：1 647-1 663.