MS营养成分对橡胶树幼态微型芽条培育的影响

桂明春 李玲 管艳 王亚 田海 梁国平

摘 要 为了探索基本培养基中各营养成分对橡胶树幼态微型芽条培育的影响情况，以橡胶树优良无性系‘云研73-477花药体胚植株为外植体，采用正交试验法研究了MS营养成分对橡胶树幼态微型芽条培育的影响。结果表明：以茎段为外植体培育幼态微型芽条时，MS培养基中4种营养成分对诱导率的影响均不显著；大量元素、有机成分及铁盐对繁殖系数的影响差异极显著；微量元素、有机成分及铁盐对死亡率的影响差异极显著，理论上最优组合为全量大量元素+4/5微量元素+全量有机成分+全量铁盐；以茎尖为外植体培育幼态微型芽条时，培养过程中，外植体无死亡现象发生，均有新芽产生；大量元素、微量元素及铁盐对繁殖系数的影响差异极显著，而有机成分不显著，理论上最优组合为2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有机成分+全量铁盐。

关键词 橡胶树；MS；幼态微型芽条；诱导率；繁殖系数

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Apex and nodal cuttings of rubber variety Yunyan 73-477 were taken as the explants， and the effects of MS elements on in vitro culture of micro-shoots were studied by an orthogonal experiment. The results showed that the effects of 4 elements in MS on the inductive rate were not significantly different at 0.05 level when nodal cuttings were selected as in vitro micro-shoots， while macronutrients， organic nutrients and iron salt had significant effects on both multiplication rate and death rate at 0.01 level. The optimum combination was macronutirents+4/5 micronutrients + organic nutrients + iron salt. No explants death was observed during culture when apex was selected as in vitro micro-shoots and all explants sprouted. The effects of macronutrients， micronutrients and iron salt on the propagation coefficient were significantly different at 0.01 level， whereas it was not significant in organic nutrients. The optimum combination was 2/5 macronutrients + 2/5 micronutrients + 4/5 organic nutrients + iron salt.

Key works Hevea brasiliensis； MS elements； Micro-shoots； Inductive rate； Multiplication rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.001

目前，天然橡胶生产中，老态芽接无性系因其能保持母树干胶产量相对较高的特性而被广泛作为植胶材料[1]。但其生长慢，经济寿命短，抗逆性差，适应性小[2]，在一定程度上制约了天然橡胶产业的发展。幼态芽接无性系较老态芽接无性系生长速度快，干胶产量高，仅次于自根幼态无性系[1]，据此，在自根幼态无性系还不能满足大面积推广种植之前，推广应用幼态芽接无性系，无疑是一种提升天然橡胶产业的有效途径[3]。目前，幼态芽接无性系的培育技术已趋成熟[1]，该技术将离体培养的橡胶树幼态微型芽条和籽苗芽接技术结合起来，不仅解决了籽苗芽接操作过程中由接穗与砧木大小不匹配所造成的困难，提高芽接成活率，且在芽接操作时，不必剖离芽片的木质部，使芽接速度显著提高。但目前适合云南植胶区优良品种的幼态微型芽条的培育技术尚未成熟[4]，尚不能为幼态芽接无性系的培育提供足量优质芽条。因此，培育云南优良橡胶树品种的幼态微型芽条已迫在眉睫。

橡胶树一直被认为是组织培养中难度较大的树种之一[5]，且对基因型的依赖性大[6]。经过橡胶树研究者的多年努力，目前已取较大进展[5-6]，在橡胶树茎尖及茎段方面亦取得较大成果，1998年，陈雄庭等[7]对橡胶树品种热研88-13、海垦2、大丰95等花药植株的微繁进行研究，并取得较大进展。随后，赵辉等[8]、邓柳红等[9]、孙小龙等[10]、桂明春等[11-12]均对橡胶树茎尖及茎段组织培养进行研究，亦取得一定的进展。但这些研究多侧重于培养基中激素及培养条件的探索。而未见有关培养基中营养成分影响的详细报道。据此，本试验以橡胶树优良无性系‘云研73-477花药体胚植株的茎段及茎尖为外植体，着重研究MS培养基中各营养成分对橡胶树幼态微型芽条培育的影响，以期为培育橡胶树幼态微型芽条提供理论依据，为橡胶树幼态芽接无性系的推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验时间、地点 试验于2015年4～12月在云南省热带作物科学研究所橡胶研究中心进行。

1.1.2 材料 以橡胶树优良无性系‘云研73-477花药体胚植株为供试材料。

1.1.3 试验仪器 数显游标卡尺（中国桂林，广陆牌，精度0.1 mm）。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 以MS培养基中大量元素（A）、微量元素（B）、有机成分（C）及铁盐（D）为试验因子，忽略因子间交互作用，按L9（34）正交试验表进行，各因子水平及浓度配比见表1、2。额外附加0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L IBA、0.2 mg/L IAA、0.5 mg/L GA3，60 g/L蔗糖，5.5 g/L琼脂。

1.2.2 试验方法 按桂明春等[4]报道的接种方法进行接种，3次重复。每支试管分装培养基35 mL，用带有透气膜的塑料盖封口，pH值为5.8～6.2。光照时间为10 h/d，光照强度为1 500 lx，培养温度为（26±0.5）℃。

1.2.3 数据统计与分析 试验过程中，每隔1周观察芽的诱导及生长情况，并作详细记录。培养45 d时统计各处理的有芽外植体节数、死亡外植体节数及不定芽数，根据桂明春等[9]的计算公式分别算出外植体的死亡率、芽的诱导率及繁殖系数。并用DPSv7.05版数据处理系统进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 MS营养成分对茎段幼态微型芽条培养的影响

培养约1周后，部分茎段的腋芽开始萌动，培养至2周时，绝大部分茎段的腋芽已萌动。继续培养，萌动芽逐渐伸长发育成新芽，新芽进一步伸长发育成5～8 cm的幼态微型芽条。在试验过程中发现，由茎段产生的新生芽有3类，I类新生芽：一个叶腋只抽出一个新芽，芽粗大，发育良好，能伸长形成芽条（图1-A）；II类新生芽：一个叶腋只抽出一个新芽，发育较差，嫩叶卷曲，不能进一步伸长发育成芽条（图1-B）；III类新生芽：一个叶腋同时抽出2个或多个新芽，只有一个新芽粗大，发育良好，能伸长形成芽条，其余新芽发育较差，不能发育成芽条（图1-C）（图2）。

表3说明，MS营养成分对茎段幼态微型芽条培育中各指标的影响不同，相对于诱导率来说，4种成分的影响差异均不显著；对于繁殖系数来说，大量元素、有机成分及铁盐的影响差异达极显著水平，微量元素则不显著；对于死亡率来说，微量元素、有机成分及铁盐的影响差异达极显著水平，大量元素则不显著。因此，本实验将繁殖系数和死亡率作为筛选适合茎段幼态微型芽条培育的MS培养基成分比例的重要指标，现对两个指标作进一步直观分析，结果见表4。

表4说明，MS培养基各营养成分对繁殖系数和外植体死亡率的影响主次顺序和优水平存在差异。相对于繁殖系数而言，因子主次顺序为A>C>D>B，即大量元素的影响最大，有机成分次之，微量元素最小，最优组合为A1B1C1D1；而对外植体死亡率来说，因子主次顺序为B>D>C>A，即微量元素的影响最大，铁盐次之，大量元素最小，最优组合为A3B2C2D1。

但上述分析并不能得出适合茎段幼态微型芽条培育适宜MS培养基各成分比例，需对单个因子进行逐一分析。相对于D因子来说，繁殖系数和外植体死亡率的优水均是水平1，故D因子的优水平是D1；相对于A因子来说，繁殖系数的优水平为A1，外植体死亡率的优水平是A3，两者的优水平不一致，但A因子对繁殖系数的影响差异达极显著水平，而对死亡率的影响则不显著（表3），故A因子的优水平为A1；同理得B因子和C因子的优水平分别为B2、C1。

综上所述，理论上适合橡胶树茎段幼态微型芽条培育的最优组合为A1B2C1D1，即全量大量元素+ 4/5微量元素+全量有机成分+全量铁盐。

2.2 MS营养成分对茎尖幼态微型芽条培养的影响

试验中发现，在试验所设的9个处理中，茎尖的顶芽和叶腋均可萌动发育成新芽，培养过程中，外植体无死亡现象发生，均有不定芽产生，诱导率为100%，死亡率为0，且每节外植体均产生多个新芽。据此，将新芽的繁殖系数作为分析MS营养对茎尖幼态微型芽条培育的考核指标，现对其进行统计分析，结果见表5、表6。

表5说明，MS培养基中大量元素、微量元素及铁盐对繁殖系数的影响差异达极显著水平，有机成分的影响则不显著。

由直观分析可知（表6），繁殖系数在组合间存在的差异较大，最高达6.22倍，最小仅为1.36倍，两者间的差异极显著；由极差R值的大小顺序可知，4个因子的主次顺序为A>D>B>C，即大量元素的影响最大，铁盐次之，有机成分最小，这与方差分析的结果一致，优组合为A3B3C2D1，即2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有机成分+全量铁盐。

表6还表明，MS培养基中4个营养成分比例的改变，繁殖系数的变化存在一定的差异，在试验所设的范围内，大量元素及微量元素比例的降低，繁殖系数随之增加；而有机成分比例降低时，繁殖系数呈先增加后降低趋势，当有机成分的比例为4/5时，繁殖系数达最大值（3.23倍），有机成分增加或降低均会使繁殖系数降低；铁盐用量的降低，繁殖系数随之降低，当MS培养基中添加全量铁盐时，繁殖系数达最大值（4.17倍）。

3 讨论

MS基本培养基是一种在植物组织培养中应用较广的基质配方，是由Murashige 和Skoog于1962 年为培养烟草细胞而设计的。因其硝酸盐、钾离子和铵离子含量较其它培养基丰富，微量元素和有机成分全面而被广泛使用[13]。也是橡胶树组织培养所通用的培养基。但不同类型材料离体培养所需的MS培养基成分比例不同，陈雄庭等[1]认为诱导花药愈伤组织的基本培养基MB的效果比MS好。黄德贵等[14]也认为MB的诱导效果较好。谭德冠等[6]认为将MS培养基中微量元素增大1倍可大大提高胚状体的诱导率，将大量元素降至80%，微量元素加倍可提高植株的再生频率。本试验结果表明，分别以体胚植株的茎段和茎尖为外植体培育幼态微型芽条，两者所需的MS培养基营养成分比例亦不同，前者适宜比例为全量大量元素+4/5微量元素+全量有机成分+全量铁盐；后者适宜比例为2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有机成分+全量铁盐。据此，在橡胶树幼态微型芽条培育中，应根据不同类型的材料来选择适合的MS培养基营养成分的比例。

在橡胶树幼态微型芽条培育中，首要解决的问题是诱导出具有伸长能力的新芽，这类芽能否诱导成功直接关系到微型幼态芽条培育的成败[4]。本试验所设的9个处理中，均有一定数量的新芽产生，但大部分芽的质量较差，不易进一步伸长发育形成可用芽条，而是在后续的培养过程中逐渐枯萎死亡或从芽的基部长出许多小芽形成簇生芽，簇生芽不能进一步伸长发育成可用芽条。由此可见，高质量新芽诱导技术的不成熟已严重制约了橡胶树幼态微型芽条的培育，是目前急需解决的技术问题之一。此外，MS培养基的4种营养成分包括多种化学物质，如大量元素包括NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4和CaCl2·2H2O或CaCl2。本试验已找出了MS培养基中营养成分对茎尖及茎段微型芽条培育的影响规律，并筛选出了最佳比例，但对各营养成分中具体化学物质的影响情况未做深入研究。王树昌等[15]认为微量元素Cu对橡胶树组培培养成胚、生根及组培苗生根有着重要影响。因此，MS培养基中4种营养成分种各化学物质对橡胶树幼态微型芽条培育的影响有待进一步研究。

参考文献

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