一株木薯拮抗内生细菌CEB33的鉴定及田间防效初步测定

陈奕鹏　霍姗姗　时涛　李超萍　杨扬　蔡吉苗　黄贵修

摘 要 以木薯细菌性萎蔫病病菌为靶标，从健康木薯组织中分离获得一株有较好抑菌作用的内生细菌。生理生化测定、形态观察及16S rDNA序列分析表明其为类芽孢杆菌属。拮抗试验表明该菌株对木薯细菌性萎蔫病菌、疫霉根腐病菌、棒孢霉叶斑病菌和胶孢炭疽病菌均有较强的抑制作用。田间防控试验表明该菌株对木薯细菌性萎蔫病有较好的防治效果，具有良好的开发前景。

关键词 木薯；拮抗内生细菌；类芽孢杆菌属

中图分类号 S435.33 文献标识码 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属灌木状多年生作物，是和马铃薯、甘薯并称的三大薯类作物之一，是世界上10亿人口日常生活中所需热能的主要来源。木薯块根富含淀粉，在粮食、饲料加工、工业原材料等方面均有广泛的用途[1]。木薯适应性强，耐旱耐瘠，主要分布在中南美洲、非洲、东南亚等热带地区和部分亚热带地区。我国木薯主产区集中在广西、广东、海南、云南和福建5个省（区），湖南、四川、贵州和江西等省也有少量栽培[2]。近年来，我国一直是世界上最大的木薯进口国[3]，国内木薯生产对相关产业的可持续发展具有重要意义。

和其它作物类似，各类严重发生的病害是木薯相關产业发展的限制性因素之一。细菌性萎蔫病，也称细菌性枯萎病，是国内木薯生产中危害最为严重的病害，可造成30%以上的产量损失[4]。疫霉根腐病、棒孢霉叶斑病和炭疽病也是我国木薯中的常见病害[5-7]。目前，国内对于木薯病害的防控主要依靠化学农药进行防治，成本高且污染环境。生物防治是未来木薯病害防控技术研究的主要方向，但相关研究还很少，特别是木薯内源拮抗微生物筛选方面尚无相关研究。笔者们在前期研究基础上，开展了木薯拮抗内生菌的分离筛选和鉴定工作，获得了一株对主要木薯病害病原菌有较强拮抗能力的内生细菌，本文为主要研究结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 木薯组织样品和病原菌菌株 健康木薯品种华南5号叶片样品来自中国热带农业科学院环境与植物保护研究所儋州试验基地。木薯细菌性萎蔫病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis）菌株GX11、木薯疫霉根腐病菌（Phytophthora palmivora）菌株CPPHN01、棒孢霉叶斑病菌（Corynespora cassiicola）菌株CCCHN01、胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株CCGHN01、大肠杆菌（Escherichia coli）菌株JM019、多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）菌株ATCC 842T均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.2 供试培养基和试剂 病原真菌菌株培养采用PDA培养基，细菌培养采用LB培养基，配方参见《植病研究方法》[8]；DNA片段回收试剂盒和pMD18-T载体购买自宝生物工程（大连）有限公司；Taq酶、dNTP和大肠杆菌TOP10感受态细胞购买自天根生化科技（北京）有限公司；引物799F（59-AACAGGATTAGATACCCTG-3′）和1492R（5′-TACG

GCTACCTTGTTACGAGTT-3′），由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；其它试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离和筛选 参照付业勤等[9]的方法，对木薯叶片样品进行表面消毒后进行内生细菌的分离和纯化。菌株的筛选参照潘羡心等[10]的对峙培养法，用木薯细菌性萎蔫病菌作为靶标菌。

1.2.2 内生细菌抑菌作用评价 菌株对木薯细菌性萎蔫病菌的抑制作用采用牛津杯法进行。将木薯细菌性萎蔫病菌培养至OD600约0.6，按照1 ∶ 20的比例将菌液与灭菌后冷却至45 ℃的NA培养基混匀后制备带菌平板。参照潘羡心[10]的方法，制备内生细菌的无菌滤液，将牛津杯放置在带菌平板的中央，加入0.2 mL的滤液，以液体NA培养基为对照，重复3次。28 ℃培养2 d后观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。

采用对峙培养法评价内生细菌对木薯疫霉根腐病菌、棒孢霉叶斑病菌和胶胞炭疽菌的抑菌作用。将病原菌菌饼接种在PDA平板的中央，将内生细菌在菌饼两侧约3 cm处进行划线接种，28 划培养7 d后，测量菌落直径，计算菌落生长抑制率。

1.2.3 内生细菌菌株鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]和《微生物学实验》[12]观察菌株CEB33的培养形态、性状、革兰氏染色反应，同时测定菌株的生理生化特征。参照潘羡心[13]的方法进行菌株16S rDNA序列的测定和分析。从数据库中下载近源物种的16S rDNA序列，应用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系统树，用Bootstrap 对系统树进行检验，1 000次重复。

1.2.4 内生细菌内生性测定 参照陈博[14]的方法，用含有氨苄青霉素的液体NA培养基对内生细菌菌株进行诱导培养，最终获得对氨苄青霉素具抗性的突变菌株。用针刺法将抗性标记菌株接种在木薯华南5号植株的健康叶片上，分别用大肠杆菌菌株JM019和无菌水做对照。28 ℃培养5 d后，取距离接种针刺点约1 cm的叶片组织，参照1.2.1的方法进行内生细菌的分离和鉴定。

1.2.5 内生细菌对木薯细菌性萎蔫病的田间防控试验

选择地势平坦，土质疏松，土壤肥力中等，上一茬种植木薯且细菌性萎蔫病发生较严重的田块进行。供试木薯品种为华南9号。试验共设3个处理和1个空白对照：CEB33菌液（OD600 0.6）、可杀得叁千（46%氢氧化铜WDG，美国杜邦公司生产，稀释1 500倍）、净刹（80%乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司生产，稀释3 000倍）及空白对照（清水），每个处理重复3次，共12个小区，小区面积100 m2，小区间设3行保护行，木薯行距100 cm，株距60 cm。

参照卢昕等[15]的方法进行药剂防效的评价。采用五点取样法对各个处理小区进行调查，每个小区调查5个点，每个点3株木薯，共15株；在每株木薯的上、中、下部不同部位各取5张复叶，共取复叶15张。按照以下标准进行分级：0级：无任何病斑；1级：病斑总面积占叶片总面积1/16以下；3级：病斑总面积占叶片总面积1/16～1/8；5级：病斑总面积占叶片总面积1/8～1/4；7级：病斑总面积占叶片总面积1/4～1/2；9级：病斑总面积占叶片总面积1/2以上或叶片变黄凋萎。按照以下公式计算各小区的病情指数，计算病害减退率，求取校正防效的平均值和标准差，用SAS9.0软件进行差异显著性分析[16]。

病情指数=（Σ各病级叶片数×相应病级数值）/（调查总叶片数×最高病害级数）×100

病害减退率=（防治前病情指数-防治后病情指数）/防治前病情指数×100%

校正防效=（各处理病害减退率-对照病害减退率）/（100-对照病害减退率）×100%

2 结果与分析

2.1 木薯内生细菌的分离与筛选

本研究从健康木薯叶片中共获得细菌分离物12株，从中筛选出3株对木薯细菌性萎蔫病病菌有较好拮抗作用的菌株，其中1株菌株的抑菌帶最宽，命名为CEB33。

2.2 CEB33的抑菌作用评价

研究发现CEB33对木薯细菌性萎蔫病菌有较好的抑菌作用，抑菌圈直径为17 mm（图1）。CEB33对木薯疫霉根腐病菌、棒孢霉叶斑病菌和炭疽病菌的抑菌率分别为60.7%、63.2%和43.9%（图2、3和4）。

2.3 CEB33菌株的鉴定

CEB33在NA平板上的菌落呈乳白色，形状不规则，表面光滑，且粘稠程度高，边缘有较高隆起。菌体短杆状近球形，有荚膜，大小为（0.6～0.8）μm×（1.0～1.2）μm，革兰氏染色为阴性，能产生椭圆形芽孢。菌株的生理生化特征测定结果见表1。

提取CEB33菌株的基因组DNA，用引物对799F和1492R进行PCR扩增后获得约0.7 kb的扩增产物。该片段克隆测序后，确认其全长为738 nt，碱基序列相似性比对发现其与类芽孢杆菌菌株CR1（登录号CP006941.2）、菌株AM49（登录号NR 025169.1）等的序列同源性为99%。该序列已提交NCBI 数据库，登录号为KX822134。从数据库中下载类芽孢杆菌属14个菌株的16S rDNA序列，构建了系统发育树（图5）。结果显示，该菌株与P. kribbensis AM49（NR025169）聚为一个分枝，和P.peoriae、P. polymyxa等亲缘关系最近，与类芽胞杆菌属其它种的亲缘关系较远。菌株形态观察、生理生化特征鉴定和16S rDNA 序列聚类分析结果表明该菌株为类芽孢杆菌属（Paenibacillus）细菌。

2.4 CEB33菌株内生性的鉴定

用含有低浓度氨苄青霉素的液体NA培养基进行CEB33的诱导培养，逐步增加氨苄青霉素的浓度，最终获得能在含有浓度为300 μg/mL氨苄青霉素的培养基上稳定生长、且菌落形态及对病原菌的拮抗作用等均保持不变的抗性菌株，命名为CEB33-amp。该菌株接种木薯叶片后，重新分离获得了培养性状等特性和CEB33-amp完全一致的培养物，而大肠杆菌和无菌水等对照处理均未分离到类似的抗性细菌。

2.5 CEB33对木薯萎蔫病菌的田间防效评价

2015年，在海南省文昌市迈号镇进行了CEB33对木薯萎蔫病的防效试验，3次施药时间分别为8月26日、9月5日和9月15日。9月25日调查时发现3个处理均无药害产生。其中CEB33的校正防效为55.0%，优于氢氧化铜（校正防效37.0%），但差于乙蒜素（校正防效73.0%）（表2）。

3 讨论

本研究经过严格的表面消毒，从健康木薯叶片中分离筛选到一株具有良好拮抗效果的内生细菌菌株CEB33，经形态观察、基础生理生化特性测定及16S rDNA序列分析，鉴定其为类芽孢杆菌。该菌株对木薯常见病害病原菌均有较好的拮抗作用，田间施用发现其对木薯萎蔫病菌有较好的防效，表明该菌株在木薯病害防控中有良好的应用前景。

植物内生细菌是指整个生活史或其部分阶段能够进入活体植物组织内，且它们的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的细菌。和病原细菌不同，内生细菌和宿主植物之间是一种共生关系。宿主植物能够为生防内生细菌提供生存空间、水份和养分，保护其不受外界环境的影响，和常规生防相比具有更好的防效稳定性。内生细菌还可作为外源基因的载体应用于生产，因此拮抗性内生细菌的研究是近年来生防研究中的热点。目前研究者几乎从所有已知的植物中都分离得到了内生细菌，本研究也发现健康的木薯组织中同样存在着对病原菌有拮抗作用的内生细菌。

类芽孢杆菌属细菌具有生长快、营养简单、能够形成具较强抗逆能力的芽孢、性能稳定等优势，是田间生产中应用潜力较大的一类菌株[17]。该类生防菌株对水稻纹枯病菌[18]、番茄早疫病菌[19]等病原真菌，番茄青枯病菌[20]等病原细菌均有较好的拮抗作用。目前生防类芽孢杆菌作用机制方面的研究，主要集中在分泌抗菌蛋白（抗菌蛋白、肽类、胞外多糖等）、与病菌竞争生态位和营养，以及诱导宿主产生系统性抗性等方面[21-23]。CEB33对木薯主要病害病原菌的抑菌作用机理将是笔者们下一步研究工作的重点。

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