微小RNA—22在食管癌中的表达及临床意义

胡立华　陈鹏　常英娟

[摘要] 目的 探讨微小RNA-22（miRNA-22）在食管癌组织中的表达及与食管癌临床病理特征间的关系。 方法 采用实时定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法检测48例食管癌及癌旁组织中miRNA-22的表达水平，分析miRNA-22表达水平与食管癌患者临床病理特征之间的关系。 结果 食管癌组织中miRNA-22相对表达量明显低于相应正常癌旁组织（3.51±1.05 vs 11.23±2.95），差异有统计学意义（P<0.05）。miRNA-22低表达与肿瘤TNM分期及有无淋巴结转移密切相关，差异有统计学意义（P<0.05）；而与性别、年龄、分化程度无明显相关性（P>0.05）。 结论 miRNA-22在食管癌组织中的表达下调与食管癌的临床病理特征密切相关。

[关键词] 微小核糖核酸；食管癌；微小核糖核酸-22；实时定量PCR

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）16-0021-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues and the relationship with the clinical pathologic features. Methods Real-time PCR was used to detect the miRNA-22 expressions among 48 cases of esophageal cancer tissues and matched adjacent tissues.The expression of miRNA-22 and clinic pathological features were analyzed. Results The esophageal cancer tissues showed aberrant down regulation of miRNA-22 compared with the adjacent non-tumor tissues（3.51±1.05 vs 11.23±2.95， P<0.05）.Lower miRNA-22 level was strongly associated with TNM stage and lymph node metastasis（P<0.05）. The correlation statistical analysis result indicated that there was no significant difference in sex， age and differentiation grade（P>0.05）. Conclusion The lower expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues is associated with clinic pathological features.

[Key words] MicroRNA； Esophageal cancer； MicroRNA-22； Real-time PCR

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]。由于早期缺乏特异性症状，临床确诊的食管癌病例多为中、晚期患者，其5年生存率仅为10%左右。因而探索敏感、特异的肿瘤标记物，早期诊断，对降低食管癌的死亡率尤为重要。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）表达失调与肿瘤发生、发展密切相关，可作为肿瘤标记物用以肿瘤的诊断及治疗。本研究通过检测miRNA-22在食管癌及癌旁组织中的表达，旨在探讨其与食管癌临床病理特征之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2014年1～12月黑龙江省医院及黑龙江省肿瘤医院外科手术切除的食管癌及癌旁正常组织标本48例，液氮冻存30 min，-80℃保存，所有样品均经病理诊断证实，术前均未接受放、化疗。其中男34例，女14例，年龄41～88岁。癌症分期按国家癌症联盟（UICC）第7版指南标准划分，其中Ⅱ期15例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例，分化程度：中分化33例，低分化15例，有淋巴结转移36例，无淋巴结转移12例。

1.2 总RNA提取

将食管癌及癌旁正常组织研碎，利用Trizol法提取组织总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度仪检测RNA溶液的D260/D280比值，取比值在1.8～2.1者行下一步实验。

1.3 反转录及实时定量PCR（qPCR）检测miRNA-22

采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，反应条件为：16℃ 30 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min。miRNA-22 PCR扩增的上游引物序列为5-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3，下游引物序列为5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3。反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共40个循环。同时选取U6 snRNA 为内参照，实验反复3次。U6内参的上游引物5GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3，下游引物R：5CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3。RT-PCR结果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt比较各样品间miRNA-22的表达差异[2]，ΔCt=待检样品的miRNA-22 Ct值-该样品的U6 Ct值，ΔΔCt值=食管癌组织的 ΔCt 值-癌旁组织的ΔCt值。

1.4 观察指标

以食管癌组织中miRNA-22表达量的中位数为分界点将其分为低表达组和高表达组[3]，分析两组与食管癌患者性别、年龄、肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移的关系。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件对实验结果进行统计学分析，计量资料组间比较采用t检验，计数资料应用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-22在食管癌及癌旁正常组织中的表达

经qPCR技术检测，食管癌组织中miRNA-22相对表达量为（3.51±1.05），明显低于相应正常癌旁组织的（11.23±2.95），差异有统计学意义（t=3.831，P<0.05）。

2.2 miRNA-22的表达与食管癌临床病理特征之间的关系

食管癌组织中miRNA-22表达水平与肿瘤淋巴结转移和TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）密切相关，有淋巴结转移患者miRNA-22的低表达率为94.4%（34/36），显著高于无淋巴结转移患者的41.7%（5/12），Ⅳ期患者miRNA-22的低表达率为90.9%（10/11），明显高于Ⅲ期患者的81.8%（18/22）和Ⅱ期患者的73.3%（11/15），差异有统计学意义（P<0.05），而与患者性别、年龄及肿瘤分化程度无显著相关性（P>0.05）。见表1。

3 讨论

MicroRNA是一类长约20～22个核苷酸的小分子RNA，由具有发夹结构约70 nt的miRNA前体经过Dicer酶加工后生成[4]，其通过与靶mRNA分子的3端非编码区（3UTR）互补结合使目标mRNA分子受到翻译水平调控或导致其降解，参与调控细胞生长分化、能量代谢、凋亡等生理过程[5]。研究发现肿瘤细胞和正常细胞中的miRNA表达谱有明显差异，约50%已知miRNA基因组定位于与肿瘤相关的脆性位点，通常可抑制肿瘤细胞的表达[6]。

分子靶向治疗是目前肿瘤治疗的热点，大多数靶向治疗药物主要针对与肿瘤相关的信号传导通路中的某个重要分子，但由于细胞中存在着多种信号传导通路，阻断其中一个分子并不能完全起到抑制肿瘤细胞的作用。一个miRNA可以同时作用于多个靶基因，通过调控miRNAs的表达水平或可更广泛地调控细胞中相关的信号传导通路，取得更好的抗肿瘤效果。有些miRNA在肿瘤中低表达或不表达，可采用外源miRNA基因导入疗法。有些miRNA在肿瘤中高表达，可采用相应的方法下调miRNA的表达。由此可见，寻找与肿瘤相关的miRNAs并明确其在肿瘤发生、发展中的作用对肿瘤的治疗具有重大意义。

2002年首次在慢性粒细胞白血病人群中发现，超过50%患者miRNA-15a和miRNA-16-l低表达或缺失[7]，此后陆续发现多种肿瘤中miRNA表达失调[8-14]。Feber等[15]比较了食管癌组织与正常上皮组织中miRNA表达情况，结果发现miRNA-203和miRNA-205在食管癌组织中的表达下调，而miRNA-21的表达上调。Tian等[16]研究指出miRNA-10b在食管癌细胞中表达失调，并通过调控KLF4 基因，参与食管癌的发生。Hiyoshi等[17]检测20例食管癌及癌旁正常组织和7种食管癌细胞系中miRNA-21的表达，结果显示：90%的癌组织miRNA-21表达上调，且与程序性细胞死亡基因4表达呈负相关。Zhou等[18]研究发现miRNA-214在食管鳞癌中表达下调并与食管鳞癌的病理分级、TNM分期及淋巴结转移相关。

本实验利用实时定量PCR技术，选择miRNA-22作为研究对象，分析48例食管癌手术患者标本中癌组织与癌旁正常组织中miRNA-22的表达情况，并对临床病理参数进行纵向比较，结果表明：食管癌组织中miRNA-22的相对表达量显著低于癌旁正常组织（P<0.05）；食管癌组织中miRNA-22低表达与肿瘤淋巴结转移和TNM 分期（Ⅲ+Ⅳ）间具有显著相关性（P<0.05），提示miRNA-22在食管癌发生、发展中很可能具有抑癌基因的作用。因此，采用外源miRNA-22 基因导入或重新激活可能成为抗癌治疗新的研究方向。

综上所述，miRNA-22在食管癌组织中的表达下调与食管癌的发生、发展密切相关，miRNA-22可能成为食管癌诊断及治疗的新的分子标志。

[参考文献]

[1] Siegel R，Naishadham D，Jemal A. Cancer statistics，2013[J].CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

[2] Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[3] Bloomston M，Frankel WL，Petrocca F，et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis[J].JAMA，2007，297（17）：1901-1908.

[4] Kaufman EJ，Miska EA. The microRNAs of caenorhabditis elegans[J]. Semin Cell Dev Biol，2010，21（7）：728-737.

[5] Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation[J]. Science，2004，303（5654）：83-86.

[6] Calin GA，Sevgnani C，Dumitu CD，et al. Human microRNA genes are fequently located at fragile sites and genomic regions involved in caccers[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2999-3004.

[7] Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad SCi USA，2002，99（24）：15524-15529.

[8] Corcoran C，Rani S，Breslin S，et al. miR-630 targets IGF1R to regulate response to HER-targeting drugs and overall cancer cell progression in HER2 over-expressing breast cancer[J]. Molecular Cancer，2014，13（1）：71-81.

[9] Jung HS，Seo YR，Yang YM，et al. Galphagep oncogene inhibits FOXO1 in hepatocellular carcinoma as a consequence of miR-135b and miR-194 dysregulation[J]. Cell Signalling，2014，26（7）：1456-1465.

[10] Yang TS，Yang XH，Wang XD，et al. MiR-214 regulate gastric cancer cell proliferation， migration and invasion by targeting PTEN[J]. Cancer Cell Inter，2013，13（1）：68-78.

[11] Wang P，Chen L，Zhang J，et al. Methylation-mediated silencing of the miR-124 genes facilitates pancreatic cancer progression and metastasis by targeting Rac1[J].Oncogene，2014，33（4）：514-524.

[12] Shang J，Yang F，Wang Y，et al. MicroRNA-23a antisense enhances 5-fluorouracil chemosensitivity through APAF-1/caspase-9 apoptotic pathway in colorectal cancer cells[J]. J Cell Biochem，2014，115（4）：772-784.

[13] 付文博，魏育涛，罗波，等. MicroRNA：潜在的新型食管癌生物标记[J]. 现代生物医学进展，2014，14（25）：4984-4986.

[14] 陈春晓，张宇忠. miRNA与消化系统肿瘤的关系[J]. 医学综述，2011，17（17）：2599-2601.

[15] Feber A，Xi L，Luketich JD，et al. MicroRNA expression profiles of esophageal cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，2008，135（2）：255-260.

[16] Tian Y，Luo A，Cai Y，et al. MicroRNA-10b promotes migration and invasion through KLF4 in human esophageal cancer cell lines[J]. J Biol Chem，2010，285（11）：7986-7994.

[17] Hiyoshi Y，Kamohara H，Karashima R，et al. MicroRNA-21 regulates the proliferation and invasion in esophageal squamous[J]. Clin Cancer Res，2009，15（6）：1915-1922.

[18] Zhou Y，Hong L. Prediction value of miR-483 and miR-214 in prognosis and multidrug resistance of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Genet Test Mol Biomarkers，2013，17（6）：470-474.

（收稿日期：2016-03-28）