天津地区辣椒病毒病调查及毒源种类初步鉴定

高苇　王勇　张春祥　张安盛　竺晓平

摘要：本研究对天津5个区县辣椒病毒病的发生情况进行初步调查，并利用6种常见蔬菜病毒的抗体采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAs-ELISA）鉴定采集到的228份病毒样品。结果表明，有186份样品呈阳性，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）检出率最高，达42.25%，为天津地区辣椒的优势毒源种类；烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、蚕豆萎蔫病毒（Broadbean wilt virus，BBWV）、番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）检出率分别为37.43%、28.34%、17.65%和20.86%；并首次在天津武清地区检出番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilf virus，TSWV）侵染辣椒。调查还发现天津地区辣椒存在2种及2种以上病毒复合侵染。

关键词：辣椒；辣椒病毒病；ELISA检测；病原鉴定；天津

中图分类号：S436.418.1⁺2 文献标识号：A 文章编号：1001—4942（2016）03—0091—04

辣椒（Capsicum annuum L.）作为全世界重要的蔬菜作物，是人们生活中必备的蔬菜和调味品，目前我国辣椒栽培面积和总产量位居世界第一位。近年来，随着设施栽培技术的发展、田间湿度的增加，辣椒病害发生的种类增多，发生程度加重，其中辣椒病毒病的发生更为严重。1923年，Doolittle首次报道了黄瓜花叶病毒（CMV）侵染辣椒，到目前为止已报道的侵染辣椒的病毒种类至少有45种。近年来，随着栽培环境和气候条件的变化，辣椒病毒病在天津地区有日益加重的趋势，一般年发病率在30%～50%，导致减产10%～30%左右，发病严重的地区甚至绝收，对辣椒生产造成了巨大的经济损失。

不同毒源引起的辣椒病毒病在症状上具有相似性，主要表现为黄化、蕨叶、植株矮小等，难以从症状上确定毒源的种类。目前，还没有系统地鉴定过危害天津地区辣椒的主要毒源种类，因此生产上对辣椒病毒病的防治存在较大的盲目性。2013年，笔者在天津市5个农业生产区县进行了大量病害调查及病毒样本采集，并利用DAS-ELISA检测方法对病毒样本进行鉴定，以明确天津地区辣椒病毒病的发生情况和主要毒源种类，为天津地区辣椒病毒病的防治及抗病育种工作的开展提供参考和依据。

1材料与方法

1.1发病情况调查与样品采集

2013年，在天津市周边5个区县（武清区、西青区、北辰区、宁河县和静海县）辣椒种植基地25块生产田开展辣椒病毒病调查，并随机采集叶片黄化、畸形、皱缩，植株矮小等疑似感染病毒病的样本。将样本统一编号、照相和症状记载，并分别装入标记的自封袋中，于-80℃冰箱中保存备用。

1.2样本处理

取样本在预冷的研钵中研磨均匀，将获得汁液与样品提取缓冲液按1：10的比例稀释，4000r/min、4℃下离心5 min，取上清液进行DAS-ELISA检测。

1.3 ELISA检测

将CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV、TYLCV六种包被抗体（AC Diagnostics公司提供）分别加入到酶标板孔中，置于4℃条件下包被过夜。弃去包被液，充分洗涤3次，吸去孔内残液。将100μ1.2中获得的样本液作为待测抗原加入到酶标板中并做好标记（阳性对照加入100 μL相应病毒阳性样品，阴性对照加入100μL样品稀释缓冲液），26℃下孵育2 h，倒掉液体，洗涤3次，吸水纸吸干孔内残液。加入现配的碱性磷酸酶（AP）标记的二抗，37℃温育2 h。洗涤后，采用新鲜配制的PNP底物溶液进行显色。用ELX800酶标仪在405 nm处测定各反应OD值，通过检测样本OD值（P）和阴性样本OD值（N）的比值，判断抗血清的效价。P/N>2.0时为阳性反应，P/N<1.5为阴性反应。

2结果与分析

2.1天津地区辣椒病毒病的发生情况

于天津5个区县共采集到疑似辣椒病毒病样本228份，发现天津地区辣椒病毒病发生较为严重，其症状主要表现为蕨叶型（图1a）、花叶型（图1b）和黄绿相间斑驳型（图1c），花期表现为开花率较低，发病后期整株矮小。调查还发现，露地栽培辣椒病毒病的发病率显著高于温室栽培辣椒；武清地区蕨叶型辣椒病毒病的发生较为普遍，发病率最高田块可达70%左右；静海县辣椒病毒病的主要症状以花叶型为主，发病率最高田块可达80%；而西青区、北辰区和宁河县辣椒病毒病发生率较低，少于20%，大多是花叶和蕨叶型混发（表1）。

2.2辣椒病毒样本DAS-ELISA检测

对228份疑似辣椒病毒病样品进行DAS-ELISA检测进而判断其致病毒源种类，结果表明，有186份样本呈阳性反应，受到CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV和TYLCV六种病毒中的1种或1种以上侵染。其中，CMV病毒检出率最高，为42.25%，TMV、ToMV、BBWV和TYLCV病毒的检出率分别为37.43%、28.34%、17.65%和20.86%，同时在武清区检出1份TSWV病毒侵染样本，为天津地区首次检出报道。天津5个区县辣椒病毒病的毒源种类具有明显差异（图2），CMV和TMV为两种主要毒源种类。武清区和西青区毒源以CMV为主；北辰区和静海县主要毒源为TMV；宁河县毒源种类较为丰富，CMV、ToMV、TYLCV和BBWV 4种病毒的检出率相似，均在30%左右。

2.3病毒复合侵染

DAS-ELISA检测显示，186份阳性样品中，单一病毒侵染率为44.09%，有104份样品（55.91%）检测到2种或2种以上病毒侵染，说明天津地区辣椒病毒病毒源种类丰富，复合侵染率较高（表2）。在辣椒病毒病复合侵染中以2种病毒复合侵染为主，共有85份。其中，CMV和TMV病毒混发的检出率最高，为13.60%，主要在武清和西青地区样本中检出。另外，CMV与ToMV混发样本检出率为8.33%，这与田间症状多以花叶和蕨叶混发为主的特征一致。2种病毒复合侵染以CMV、TYLCV、BBWV与其它病毒混合侵染为主。其中，BBWV复合侵染的病毒检出样本均采自宁河县造甲城镇造甲村露地栽培的辣椒上，可能与当地露地栽培品种复杂、不同蔬菜品种上的病毒复合侵染有关。ToMV与其它病毒混发样本主要集中在静海和宁河县。3种病毒复合侵染的检出率显著低于2种病毒复合侵染，CMV+TYLCV+ToMV检出率为2.63%，ToMV+TYLCV+BBWV检出率为3.51%，TMV+BBWV+ToMV检出率1.75%。另外，在天津地区仅检出1份样本受到4种病毒复合侵染，复合侵染病毒种类为CMV+TMV+TYLCV+BBWV，该样本采自宁河县露地栽培辣椒。

3结论与讨论

近年来，辣椒病毒病的发生尤为严重，由原来的次要病害逐渐上升为主要病害，严重影响辣椒的产量和品质。本研究对天津地区辣椒病毒病的发生情况进行调查，发现该地区辣椒病毒病的发生率平均在20%～30%，露地辣椒的发生率显著高于设施栽培辣椒，这与病毒病的传播媒介主要为蚜虫、蓟马、粉虱等具有显著相关性。天津地区辣椒病毒病的症状以黄化、蕨叶、花叶、皱缩、植株矮小为主，难以从症状上判断病原种类，一旦发生难以控制，显著降低辣椒产量和农民收入。本研究利用DAS-ELISA方法对天津地区采集的辣椒病毒病样品进行毒源鉴定，结果CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV和TYLCV六种常见病毒均有检出，其中TSWV病毒为天津地区的首次检出报道。目前，我国北京、辽宁、江苏、吉林、四川、陕西、重庆等地区均广泛开展了辣椒病毒病毒源种类调查，先后报道了CMV、TMV、PVX、PVY、TEV、PMMoV、AMV、BBWV、TSWV、TYLCV、GYSV、CaCV、TMGMV等16种病毒侵染辣椒。调查显示辣椒病毒病的主要毒源以CMV和TMV为主，而且常常是2种或2种以上病毒复合侵染，这与天津地区辣椒病毒病的发生及种类具有相似性。天津地区不同区县优势毒源种类具有明显差异，武清区和西青区毒源以CMV为主；北辰区和静海县主要毒源为TMV；宁河县毒源种类较为丰富，CMV、ToMV、TYLCV和BBWV 4种病毒的检出率相似，均在30%左右，这很可能与当地的栽培环境及栽培品种有关。此外，病毒CMV极易与其它毒源复合侵染，常表现为2种病毒复合侵染，占总阳性样本检出率的31.18%。另外，露地栽培辣椒病毒复合侵染的发生率显著高于设施栽培辣椒，这与露地混合栽培品种多样、易发生交叉侵染相关。结合检测结果及病毒病发生特点分析，笔者认为辣椒病毒病防治应主要采取预防措施，通过有效应用防虫网、黄板等手段避免传播媒介滋生、扩散。

本研究仅采用6种常见蔬菜病毒抗体对采集到的228份疑似样本进行检测，无法涵盖天津地区辣椒病毒病的所有毒源种类，该地区是否有其它毒源种类仍需进一步鉴定。另外，由于病毒病症状复杂，无法将毒源种类和症状进行显著关联，对于辣椒病毒病症状诊断的实现有待进一步研究。