甘蔗茎尖组织培养过程酚类物质变化及其与褐变的关系

汪淼　唐云仙　杨柳　廖芬

摘要：【目的】探討甘蔗茎尖组织培养过程中酚类物质种类及其含量变化与甘蔗茎尖褐变的关系，为甘蔗茎尖离体培养褐变机理研究及解决褐变问题提供理论依据。【方法】利用高效液相色谱对甘蔗茎尖组织培养过程中的酚类物质（绿原酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素）进行定性和定量分析，研究酚类物质组成和含量在茎尖组织褐變过程中的变化规律及其与褐变的关系。【结果】甘蔗茎尖褐变率增加量随接种时间的延长呈先上升后下降的变化趋势，接种后第3～6 d褐变严重，褐变率增加量在第6 d达峰值（16%），之后呈下降趋势。接种培养后0～12 d，正常生长和褐变的甘蔗茎尖均检测出没食子酸、绿原酸、儿茶素和表儿茶素4种酚类物质。接种当天4种多酚物质含量均最高；接种后3～6 d，褐变现象严重，褐变率迅速增加，没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量显著下降（P<0.05）。相关性分析结果表明，褐变率增加量与酚类物质含量呈负相关，其中与表儿茶素含量的负相关达极显著水平（P<0.01），Pearson相关性系数为0.825。【结论】甘蔗茎尖褐变率增加量与酚类物质含量呈负相关，而表儿茶素为甘蔗茎尖组织培养过程中的主要酚类物质。

关键词： 甘蔗茎尖；组织培养；酚类物质；褐变

中图分类号： S566. 1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0622-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate contents and types of phenols related to sugarcane stem tip browning during in vitro tissue culture， and analyze relationship between browning and polyphenols， in order to theoretical basis for studying browning mechanism of sugarcane stem tip in vitro culture and its countermeasures.【Method】The types and content of phenols（gallic acid， chlorogenic acid， catechuic acid and epicatechin） in sugarcane stem tips was determined during in vitro tissue culture using high performance liquid chromatography（HPLC）. The relationship between browning and phenolics alternation was analyzed. 【Result】The results showed that， the increment of browning rate first increased and then decreased with extension of time after inoculation， serious browning was found from the 3rd day to 6th day after inoculation， especially on the 6th day， the increment of browning rate was up to the highest value（16%）， and decreased gradually after then. Moreover， four phenols were detected from both browning and normal stem tips within 0-12 d after inoculation， including gallic acid， chlorogenic acid， catechuic acid and epicatechin. On the day of inoculation， four phenols were found to be the highest. And from the 3rd to 6th day after inoculation， the browning rate increased rapidly， while the contents of gallic acid， catechuic acid and epicatechin declined significantly（P<0.05）. The correlation analysis showed that， the increment of browning rate was negatively correlated with contents of phenols， and exteremely significantly negatively correlated with epicatechin（P<0.01）with Pearson correlation coefficient of 0.825. 【Conclusion】The increment of browning rate of sugarcane stem tip is negatively correlated with phenols content， and epicatechin is one of the main phenols during in vitro tissue culture.

Key words： sugarcane stem tip； tissue culture； phenols； browning

0 引言

【研究意义】外植体褐变及污染、玻璃化现象为植物组织培养的三大难题（赵蓬晖等，2001）。褐变（酚害）分为酶促褐变和非酶促褐变两种，目前普遍认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起，而底物、酶和氧是酶促褐变的3个必备条件（李海明等，2003）。酚类物质普遍存在于正常植物的細胞内，与氧化酶同时存在，正常情况下并不发生褐变，当细胞的结构发生破坏时，酶和底物的区域性分布被打破，使酶和底物接触，便在有氧条件下产生褐变现象（Laukkanen et al.，1999）。甘蔗是无性繁殖作物，多年连作后极易受病害侵染，利用茎尖组织培养生产脱毒健康种苗是目前普遍采用的控制病害的方法。但甘蔗是一种多酚类物质含量较高的作物，尤其是幼嫩茎尖和嫩叶鞘含量更高（秦廷豪等，1997），在茎尖培养时，由于接种时不可避免的切割和继代培养中细胞受到破坏，细胞内酚类物质聚集与氧化而导致的酶促褐变是影响甘蔗丛生芽诱导、增殖及组培苗质量的重要因素之一。因此，有效解决褐变问题是甘蔗茎尖培养获得成功的关键。酚类物质作为酶促褐变的底物，是促使愈伤组织褐变的主要原因之一。阐明与甘蔗茎尖组织培养褐变相关的酚类物质种类，探讨酚类物质与甘蔗茎尖组织培养褐变的关系，对深入探索甘蔗茎尖离体培养褐变机理，进而从根本上解决褐变问题、完善甘蔗组织培养技术具有重要意义。【前人研究进展】甘蔗褐变现象的影响因素复杂多样，因外植体生长部位、生理状态、培养基及培养条件等的不同而不同。秦廷豪等（1997）、贤武等（2000）研究表明，外源激素会加重植物组织培养褐变现象，因此，降低激素含量可提高茎芽成活率和丛芽诱导率，且可极大降低褐变。卢文祥等（2002）研究发现，甘蔗外植体的最佳采集时期是每年的6～8月，与其他季节相比，夏季甘蔗生长处于拔节期，采芽培养诱导成活率高，而冬季采集的外植体容易褐变且诱导期长。人为的切割、高温、高CO2及强光照均会促使褐变发生（杨柳等，2007；刘野等，2011）。甘蔗组织培养中抑制褐变产生的常用方法一般有在培养基中添加吸附剂或褐变抑制剂、在最佳季节采集外植体、选择幼嫩组织、选择适宜的培养基和培养条件（如暗培养、选择液体培养基、低盐培养基）、进行多次转接及接种前在水中或抗氧化剂中浸泡等（李海明等，2003；黄诚梅等，2004），这些方法极大地提高了组织培养的成功率，但每种方法均有其适用范围和局限性，制约了其在大规模工业化组培生产中的应用。【本研究切入点】前人对甘蔗组织培养褐变的研究主要集中于影响褐变的因素及如何通过改变这些影响因素减轻褐变带来的危害方面，而有关甘蔗茎尖组织培养褐变机理的研究尚未见深入报道。【拟解决的关键问题】通过对甘蔗茎尖组织培养过程中酚类物质的定性与定量分析，阐明与甘蔗茎尖组织培养褐变相关的酚类物质种类，并探讨酚类物质含量变化与茎尖褐变的关系，以期为甘蔗茎尖離体培养褐变机理研究及从根本上解决褐变问题提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用甘蔗品种为ROC22，来源于广西农业科学院甘蔗研究所试验基地。将蔗茎砍成单芽段，单芽蔗茎长度为5 cm，38 ℃恒温催芽28 d后用于接种。没食子酸、儿茶素、绿原酸和表儿茶素标准品均为色谱纯（美国Sigma公司），甲醇、醋酸为色谱纯试剂（美国Fisher公司）。

1. 2 试验方法

取甘蔗单芽苗，在超净工作台上剥去甘蔗茎尖，然后接种到培养基（MS+3 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂）上，28 ℃下暗培养。

1. 2. 1 甘蔗茎尖褐化率变化 分别于接种后3、6、9和12 d统计褐化率的变化。3次重复，每个重复接种50个茎尖。褐化率增加量（%）=新增褐化数/总接种数×100。

1. 2. 2 标准品制备 根据前人的研究结果（孙晓雪，2007；陈纯，2013）选取没食子酸、儿茶素、绿原酸和表儿茶素4种酚类物质为研究对象。分别称取没食子酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.00 mg/mL的绿原酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素对照品母液，另分别取对照品母液配制混合溶液，混合溶液的质量浓度为0.20、0.10、0.05、0.02和0.01 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，将配好的标准混合液保存备用。

1. 2. 3 酚类物质提取及分析 分别于接种后0、3、6、9和12 d取样，除0 d外，其余天数取正常生长和褐变的材料进行对比。称取甘蔗样品0.5 g于10 mL容量瓶中，放入超声波仪器中超声波提取60 min，将液体经过0.22 μm滤膜过滤，得到样品粗溶液。酚类物质的定性定量分析采用Waters E2695高效液相色谱仪，色谱柱：C18酚酸柱；流动相A为甲醇，流动相B为1%醋酸；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：280 nm；分析时间：25 min。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2007制图、采用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 甘蔗茎尖褐变率增加量的变化

由图1可看出，甘蔗茎尖的褐变率增加量随接种时间的延长呈先上升后下降的变化趋势。从接种后第3 d开始，褐变率增加量明显上升，接种后第6 d达峰值（16%），说明在接种后3～6 d的时间段内褐化比较严重，褐化茎尖个数较多。接种后6～12 d，褐变率增加量逐渐降低。

2. 2 褐变过程中茎尖多酚类物质含量变化

2. 2. 1 混合标准品的测定结果 如图2所示，在1.2.3所述色谱条件下进行分析，没食子酸、儿茶素、绿原酸和表儿茶素均能得到良好的分离，说明此分离条件能达到较好的分离效果。

2. 2. 2 酚类物质含量变化

2. 2. 2. 1 没食子酸含量 由图3可看出，随着接种时间的延长，甘蔗茎尖内的没食子酸含量整体上呈降低趋势。接种当天（0 d）甘蔗茎尖内没食子酸的含量高于1.10 μg/g；接种后3 d，正常和褐变材料的没食子酸含量均显著低于接种当天的含量（P<0.05，下同），分别为0.43和0.29 μg/g；接种后6 d，褐变材料的没食子酸含量继续降低，显著低于接种后3 d的含量，为0.17 μg/g，正常材料的没食子酸含量无显著变化（P>0.05，下同）；接种后9和12 d，正常材料茎尖的没食子酸含量显著低于前期，褐变材料的没食子酸含量则与接种后6 d无显著差异。在接种后的第3和6 d，褐變材料的没食子酸含量显著低于正常材料，之后随着接种时间的延长，其含量与正常材料无显著差异。

2. 2. 2. 2 儿茶素含量 由图4可看出，随着接种时间的延长，甘蔗茎尖内的儿茶素含量呈先降低后略微升高的变化趋势。接种当天（0 d）甘蔗茎尖内的儿茶素含量高于3.20 μg/g；接种后3～9 d，正常和褐变材料的儿茶素的含量均持续降低，第9 d时达最低值，分别为0.19和0.35 μg/g；接种后第12 d，两种材料的儿茶素含量均有所回升。接种后的第3 d，褐变材料的儿茶素含量显著低于正常材料，之后随着接种時间的延长，两者的儿茶素含量无显著差异。

2. 2. 2. 3 绿原酸含量 由图5可看出，甘蔗茎尖内的绿原酸含量在接种当天（0 d）接近1.00 μg/g；接种后3 d，正常和褐变材料的绿原酸含量均显著低于接种当天，之后随着接种时间的延长，两种材料的绿原酸含量变化不明显。整个培养过程中，正常生长甘蔗茎尖内的绿原酸含量均显著高于褐变材料。

2. 2. 2. 4 表儿茶素含量 由图6可看出，随着接种时间的延长，甘蔗茎尖内的儿茶素含量呈先降低后升高的变化趋势。接种当天（0 d）甘蔗茎尖内的表儿茶素含量高于3.50 μg/g，接种后3 d，正常和褐变材料的表儿茶素含量均显著低于接种当天；接种后6 d，两种材料的表儿茶素含量降至最低值，分别为0.77和0.20 μg/g；接种后9～12 d，正常和褐变材料的表儿茶素含量均持续升高。在接种后的第3、6和12 d，褐变材料的表儿茶素含量显著低于正常材料，第9 d时与正常材料差异不显著。

2. 2. 3 褐变率增加量与酚类物质含量的相关性 由表1可知，褐变率增加量与4种酚类物质含量呈负相关，其中与表儿茶素含量的负相关达极显著水平（P<0.01），Pearson相关性系数为0.825。

3 讨论

不同植物所含的酚类物质种类及含量不同，参与褐变过程的主要酚类物质也不同。孙晓雪（2007）研究认为，甘蔗梢中的酚类物质包括表儿茶素、儿茶素、绿原酸和没食子酸，其中以表儿茶素含量最高。印芳等（2008）利用高效液相色谱对3个褐变程度不同的蝴蝶兰品种进行9种酚酸的定性定量分析，认为绿原酸、邻苯二酚、儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对羟基苯甲酸和香豆酸可能与蝴蝶兰褐变相关，苯甲酸对蝴蝶兰褐变影响较小。本研究在甘蔗茎尖培养过程中共检测到4种酚类物质，包括没食子酸、绿原酸、儿茶素和表儿茶素，其中表儿茶素含量在整个培养过程中均最高，因此推测表儿茶素可能是甘蔗茎尖内主要的酚类物质，与孙晓雪（2007）对甘蔗梢中多酚的研究结果基本一致。对甘蔗茎尖组织培养过程中酚类物质的定性定量分析结果表明，接种当天甘蔗茎尖内4种酚类物质的含量最高，可能是因为接种切割刺激甘蔗产生了大量酚类物质；接种后第3 d， 4种酚类物质含量明显减少，褐变现象严重，第3～6 d褐变率迅速增加，没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量继续下降，且在褐变增加最快阶段正常材料的酚类物质含量均显著高于褐变材料，所检测到的酚类物质含量与甘蔗茎尖褐变率呈负相关，其中表儿茶素含量与茎尖褐变率的负相关达极显著水平，说明甘蔗茎尖组织内的酚类物质很可能参与了酶促褐变，在氧化酶的作用下被氧化成醌，因此其含量降低。这与及华等（2006）对梨组织培养中外植体褐变研究表明的酚类物质含量与组织培养褐变率有一定相关性，在梨外植体褐变中起决定性作用的研究结果相似。印芳等（2008）研究发现，蝴蝶兰组织培养褐变过程中PPO活性高峰出现在接种后第2 d，第6 d后变化不明显。甘蔗茎尖培养过程中检测到的酚类物质含量在培养第3 d显著下降，第6 d后变化不明显，甘蔗茎尖中酚类物质含量的变化与蝴蝶兰外植体褐变过程中PPO活性的变化有一定的相关性，也进一步证明这些酚类物质很有可能作为底物参与了甘蔗组织培养酶促褐变反应，被氧化酶氧化，从而导致褐变。随着甘蔗茎尖培养时间的延长，表儿茶素和儿茶素含量在培养后期又有所上升，可能是因为二者不仅参与了褐变反应，还在其他逆境生理方面起作用，具体作用机理有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，甘蔗茎尖组织培养过程中检测出了没食子酸、儿茶素、绿原酸和表儿茶素4种酚类物质，其中以表儿茶素含量最高，为主要的酚类物质；褐变率增加量与酚类物质含量呈负相关。

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（责任编辑 温国泉）