基于转录组信息的艾纳香牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（BbGPPS）的克隆及序列分析

官玲亮 夏奇峰 石小兵 蓝惠萍 陈振夏 赵致 庞玉新

摘 要 采用RT-PCR和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术，从艾纳香（Blumea balsamifera L. DC）的叶片中克隆到单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶（BbGPPS）基因。研究结果显示，BbGPPS基因的cDNA全长1 692 bp，包含开放阅读框（ORF）1 083 bp，编码361个氨基酸；亚细胞结构定位于叶绿体，既非膜蛋白也非分泌性蛋白。疏水性分析显示，BbGPPS是亲水性蛋白。同源性比对结果显示，BbGPPS蛋白与其他植物中GPPS蛋白具有高度的相似性，且具有异戊烯基结构域。系统发育分析表明，所有序列被聚为5大类，BbGPPS与其他菊科植物聚类一类，与万寿菊（Tagetes erecta）TeGPPS亲缘关系最近，其次是甜菊（Stevia rebaudiana）SrGPPS。

关键词 艾纳香；牻牛儿基焦磷酸合成酶；氨基酸序列；系统发育分析

中图分类号 S567；Q78 文献标识码 A

Abstract A geranyl diphosphate synthase gene， designated BbGPPS， was cloned from Blumea balsamifera L. DC using reverse transcription polymerase chain reaction approach（RT-PCR）and rapid amplification of cDNA ends（RACE）methods. The results showed that The BbGPPS cDNA had a full length of 1 692 bp， and contained an open reading frame predicting a polypeptide of 361 amino acids. Hydropathy and subcellular localization prediction showed that the BbGPPS belonged to hydrophilic protein and located in Chloroplasts. It was neither a membrane protein nor a secretory protein. BbGPPS protein showed a high similarity with other plant GPPS genes， containing isopentenyl domain. Phylogenetic analysis indicated that the amino acid sequence was divided into five categories and BbGPPS grouped with other composite plant GPPS， such as Tagetes erecta TeGPPS and Stevia rebaudiana SrGPPS.

Key words Blumea balsamifera L. DC； Geranyl diphosphate synthase； Amino acid sequence； Phylogenetic analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.009

艾纳香（Blumea balsamifera L. DC）为菊科艾纳香属多年生木质草本植物，最早记载于公元741年（唐开元二十九年）陈藏器所编著《本草拾遗》，此后宋代刘翰等编著《开宝本草》（公元973～974年）也曾记载[1]。艾纳香以根、嫩枝、叶入药，其性微温，味辛、微苦，具有祛风消肿、活血散瘀之功效，可用于治疗感冒、风湿性关节炎、产后风痛、痛经、 外用跌打损伤、疮疖痛肿、湿疹皮炎。另外，艾纳香还具有抗氧化、抗癌和抗病毒的作用[2]。主要分布于中国海南、贵州、广西、广东、云南、台湾等省。在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有着悠久的药用历史，是一种重要的民间药物。左旋龙脑（L-龙脑）又名艾片，是艾纳香中重要的次生代谢产物，是艾纳香主要的药用活性成分。现代药理学研究证实，L-龙脑具有抗炎、抗氧化、镇痛、促进药物吸收、提神醒脑等作用[3]。田徽等[4]研究发现，艾片能显著改善生理和病理状态下的脑缺血缺氧从而发挥脑保护作用，可能是其具有“提神醒脑”作用的药效学基础。龙脑能够迅速透过血脑屏障，分布于脑组织中，改善血脑屏障紧密连接的破坏，能够抵抗自由基对脑组织的损伤。研究还发现，L-龙脑具有显著的抗小鼠心肌与脑缺血缺氧的作用[5-6]。

L-龙脑属于双环单萜化合物，在高等植物中，萜类生物合成途径是生物体内主要的代谢途径之一，由该途径产生的萜类化合物（Terpenoid）数量庞大，目前已鉴定出的萜类化合物多达20 000余种，占天然产物总数的25%～50%，半数以上的萜类化合物是在植物中被发现的，对植物的生长、发育以及植物与生态环境之间的联系起着极其重要的作用。萜类化合物是由异戊二烯为基本结构单元构建的一类化合物， 异戊烯焦磷酸（IPP）与其异构体（DMAPP）被称为“活性异戊二烯”，是萜类合成真正的前体，牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase， GPPS）催化1分子的IPP与DMAPP形成牻牛儿基焦磷酸（GPP），为单萜合成提供碳骨架[7-13]。

目前已从多种植物中克隆得到GPPS基因，高等植物不同物种之间的GPPS在氨基酸序列具有较高的相似性，蛋白质结构域分析表明，不同物种间的GPPS具有保守的结构域[14-16]。艾纳香在化学成分、药理、药效等方面研究较多，并取得显著成果。然而关于艾纳香在分子生物学方面的研究尚未起步，本研究通过对艾纳香BbGPPS基因的克隆和信息学分析，有望从分子水平揭示艾纳香活性成分代谢途径和调控机制，为提高艾纳香活性成分的含量奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 艾纳香（Blumea balsamifera L. DC）栽培于海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药种质资源圃，试验材料为艾纳香长势良好的花和叶。

1.1.2 试剂 总RNA提取试剂盒（Plant RNA Kit）、反转录试剂盒、载体连接试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal、多功能DNA纯化回收试剂盒均购自广州飞扬生物工程有限公司。引物合成与测序均由上海美吉（Majorbio）生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及BbGPPS全长cDNA的克隆

按照Plant RNA Kit试剂盒说明书，提取艾纳香叶片的总RNA，采用RT-PCR合成cDNA第一链。通过从本课题组前期对艾纳香花和叶片转录组的信息，挖掘艾纳香中GPPS相关基因的序列片段，设计特异引物扩增cDNA。正向引物Pf：5′-TCCGATAGATACCCCTCA-3′、反向引物Pr：5′-CATCACTACTCACCCAACTC-3′，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系：PCR反应总体积为50 μL，1.5 mmol/L MgCl2，4种dNTP各200 μmol/L，引物各150 ng，1.5 U Taq plus DNA polymerase（高保真），100 ng cDNA。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃后延伸10 min。并进行克隆、测序及序列分析。

1.2.2 BbGPPS基因的测序与分析 BbGPPS PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化，纯化后将其连接到pEASY-Blunt cloning vector载体上，转化E. coli Trans1-T1感受态细胞，涂布于添加氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB平板上，37 ℃培养箱中培养过夜，随机挑取阳性克隆，使用M13 Pf/Pr引物，经PCR检测后扩菌培养，再送样进行测序，获得重组载体pEASY-Blunt-BbGPPS。

1.3 数据分析

使用DNAMAN软件分析BbGPPS基因的cDNA序列，找到对应的开放阅读框（ORF）以及对应编码的氨基酸序列；利用DNAMAN软件的多序列比对功能，将BbGPPS氨基酸序列与NCBI中BLAST检索到的高同源性序列进行比对，对保守区域进行考察；使用BioEdit等软件对BbGPPS氨基酸序列的理化性质进行分析，并使用Swiss-model工具对BbGPPS的三维结构在线进行预测；最后利用Mega5.0将BbGPPS氨基酸序列与从NCBI中进行BLAST比对搜索得到的序列进行系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 BbGPPS cDNA序列分析

本研究从艾纳香叶片中克隆得到BbGPPS基因的cDNA序列全长。提取的RNA以及扩增的序列片段如图1所示，本研究在约1 600 bp处，出现单一的目的条带。该基因全长1 692 bp，开放阅读框（ORF）在cDNA序列上的区域为第219～1 302个核苷酸，ORF全长1 083 bp，碱基序列如图2所示。

2.2 BbGPPS氨基酸序列分析

通过BbGPPS cDNA序列预测得到其编码的氨基酸序列，结果显示BbGPPS肽链包含有361个氨基酸残基，分子量为39.130 ku，等电点（pI）为5.83（图3）。氨基酸的种类分布如图4所示，该肽链总共含有19种氨基酸，不含色氨酸。含量最多的氨基酸种类为亮氨酸和丙氨酸，而半胱氨酸、组氨酸以及酪氨酸的含量则相对较少。总体而言，极性氨基酸的含量相对较高。

2.3 BbGPPS跨膜区、信号肽、亚细胞定位分析

使用TMHMM预测BbGPPS的跨膜区域，分析结果表明，BbGPPS无跨膜区，属于膜外在蛋白；利用ExPASy SignalP4.0Serve分析BbGPPS蛋白，并没有发现信号肽，表明该蛋白为非分泌蛋白；用WoLFPSORT工具对BbGPPS进行亚细胞结构定位预测，预测结果表明，BbGPPS最可能定位于叶绿体，定位系数为8（chlo： 8）（图5）。

2.4 BbGPPS疏水性分析

使用BioEdit软件对BbGPPS进行疏水性分析，分析结果表明，BbGPPS亲水性略大于疏水性，BbGPPS属于亲水蛋白。在第50～60个氨基酸残基之间，有一个强亲水区域，大约在第165个氨基酸残基处，还有一个亲水性较强的区域（图6）。

2.5 BbGPPS序列比对

使用NCBI的BLAST工具，将BbGPPS序列在蛋白质数据库中进行比对搜索。BbGPPS在蛋白质数据库中比对上不同物种的37条蛋白质序列，其中BbGPPS与万寿菊GPPS（TeGPPS）序列相似性最高，达到84%。利用DNAMAN将BbGPPS氨基酸序列与从NCBI中挑选的部分同源性较高的已知序列进行多序列比对，结果表明BbGPPS蛋白与其他植物中GPPS蛋白具有高度的同源性，且具有异戊烯基结构域，进一步表明BbGPPS为异戊烯基合酶超家族成员（图7）。根据王彩云等[16]对滇龙胆GPPS的预测分析结果，GPPS基因具有的保守结构域主要是聚丙烯合成酶（Polyprenylsynthetase）多位于 105～354位、286～298位和153～169位；萜类合成酶（Terpenoid synthase）多位于75～366位和77～363位；聚丙烯相关合成酶（Polyprenyl synthetase-related）多位于61～365位。

2.6 蛋白质二级结构预测和三维建模

利用SSpro 4.0（http：//download.igb.uci.edu/sspro4.html）对BbGPPS进行二级结构分析。结果表明该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占61.8%，β-折叠（E）占1.7%，无规则卷曲（C）占36.5%。

使用Swiss-model工具对BbGPPS的三维结构在线进行预测（图8）。从图8可以看到，BbGPPS的三维结构主要由α-螺旋构成，其次是无规则卷曲。β-折叠只占有很少的一部分，三维结构预测的结果与蛋白质二级结构预测相吻合。分析结果表明，BbGPPS属于α-螺旋型蛋白。其三维结构的“口袋”区域，可能是BbGPPS起催化作用的活性中心所在。

2.7 BbGPPS与其他物种GPPS间系统进化分析

利用Mega5.0将BbGPPS氨基酸序列与从NCBI中BLAST比对搜索得到的序列（表1）进行系统进化分析，由结果可知位于系统发育树最下方的川桑（Morus notabilis， MnGPPS）、苹果（Malus domestica， MdGPPS）、杜仲（Eucommia ulmoides， EuGPPS）、金鱼草（Antirrhinum majus， AmGPPS）、野甘草（Scoparia dulcis， SdGPPS）成为一个独立的初级分支Ⅰ，表明这一个分支的物种与其余物种之间亲缘关系较远；在初级分支Ⅱ下，可细分出两个大的次级分支，艾纳香（Blumea balsamifera， BbGPPS）、万寿菊（Tagetes erecta， TeGPPS）、案头菊（Chrysanthemum x morifolium， CxmGPPS）、野菊（Chrysanthemum boreale， CbGPPS）、甜菊（Stevia rebaudiana， SrGPPS）同属于菊科植物，均位于一个大的次级分支上，其中艾纳香与万寿菊、甜菊位于同一条多级进化分支上，表明其亲缘关系较近（图9），这与形态学植物分类结果相似，表明GPPS基因可为植物分类方面的分析或研究提供一定的佐证。

3 讨论与结论

本研究基于艾纳香花和叶的转录组数据信息，根据挖掘到的GPPS基因的序列片段，设计特异性引物从艾纳香总RNA中扩增BbGPPS的全长cDNA序列。将扩增得到的cDNA通过克隆、测序验证，证实扩增得到的cDNA序列是正确的。

BbGPPS cDNA全长1 692 bp，编码的BbGPPS蛋白质序列包含361个氨基酸残基，其中不含有色氨酸。BbGPPS为膜外在蛋白，定位在叶绿体发挥其生物功能，不含有信号肽序列，表明BbGPPS为非分泌蛋白，疏水性分析表明BbGPPS为亲水性蛋白，在氨基酸序列中具有两个较强的亲水区域。系统发育分析证明，艾纳香与万寿菊等其余4种菊科植物亲缘关系较近，BbGPPS序列的系统发育分析结果与艾纳香已有的种属分类相一致，进一步说明本次分析的结果是具有较高真实性和可信度的。

GPPS属于蛋白超家族，在高等植物不同物种之间具有较高的保守性。高等植物不同物种GPPS研究已有较多的文献报道，不论是GPPS cDNA序列长度或是编码的GPPS氨基酸个数都有较大的相似性。GPPS基因具有的保守结构域主要是聚丙烯合成酶（Polyprenylsynthetase）；萜类合成酶（Terpenoid synthase）；聚丙烯相关合成酶（Polyprenyl synthetase-related）。使用DNAMAN软件，将艾纳香BbGPPS与同源性较高的多条序列进行比对，发现BbGPPS氨基酸序列存在多个保守结构域，与前人对其他物种的GPPS氨基酸序列研究成果相一致，证明BbGPPS同属于GPPS蛋白超家族中的一员。于盱等[15]研究发现，薄荷GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1 131 bp，编码377个氨基酸，GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp，编码313个氨基酸；王彩云等[16]研究发现，龙胆GPPS cDNA全长1 107 bp，编码369个氨基酸。本次cDNA测序结果、BbGPPS氨基酸序列预测结果与前人对其他物种GPPS的序列分析结果相似，进一步证明本次克隆的BbGPPS也是异戊烯基合酶超家族成员。

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