不同发酵方式对海南粗榧内生真菌CH1307c合成次级代谢产物的影响

林淑婷　李从发　胡晓苹　刘翊昊　徐传标　李培　周偏　刘四新

摘 要 为研究不同发酵方式对内生真菌次级代谢产物产量、成分类别及其对3种常见白血病细胞株的细胞毒活性影响。分别采用大米固态发酵、麦麸固态发酵、马铃薯液态静置发酵、马铃薯动态发酵4种发酵方式对分离自海南粗榧韧皮部内生真菌CH1307c进行发酵，并采用乙酸乙酯进行萃取，通过试管定性试验和MTT试验测定其粗提物的成分类别及其对细胞株K562、NB4、HL60的细胞毒活性。结果表明：大米固态发酵、麦麸固态发酵的次级代谢粗提物产量相对于马铃薯动态发酵分别增加了45.9倍和28倍；马铃薯动态发酵较其静置发酵产量高9.1倍。试管定性试验结果表明，大米固态发酵获得的粗提物，化合物种类最多，麦麸发酵和动态发酵次之，马铃薯液态静置发酵最少。此外，4种发酵方式获得的代谢粗提物对3株细胞株的抗肿瘤活性（IC50值）并未呈现明显差异。研究结果为该菌株的大规模发酵提供理论依据。

关键词 海南粗榧；发酵方式；内生真菌；化学成分；抗癌活性

中图分类号 R284 文献标识码 A

Abstract The effect of the different fermentation methods for the endophytic fungus on the yield of secondary metabolites component categories and the cytotoxic activities against the three common leukemia cell lines was investigated. The methods of rice solid-state fermentation， wheat bran solid-state fermentation， potato liquid-standing and potato dynamic fermentation were carried out for CH1307c， which was isolated from phloem of Cephalotaxus hainanensis Li， and culture media were extracted with ethyl acetate. The categories of the crude extractions and their cytotoxic activities against cells K562， NB4 and HL60 were determined by using in vitro qualitative test and MTT test. Compared to the potato dynamic fermentation， the yields of secondary metabolites by rice and bran solid-state fermentation were increased by 45.9 and 28 times， respectively. In addition， the yield of potato dynamic fermentation was higher than its static way with 9.1 times. The results of in vitro qualitative test showed that component species of crude extraction by rice solid-state fermentation was richest， those by wheat bran solid-state and potato dynamic fermentation were second， and that by potato standing fermentation was fewest. Furthermore， the antitumor activities of secondary metabolites of the crude extractions by four fermentation ways towards the three cell lines（concentration of IC50 value）did not exhibit obvious difference. This study provide a theoretical basis to the large-scale fermentation of the strain.

Key words Cephalotaxus hainanensis Li； Fermentation； Endophytic fungi； Chemical composition； Antitumor activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.026

植物内生真菌（endophyte）是指可在健康植物组织内部稳定生活而不引起宿主病变的一类真菌[1]。从其次级代谢产物中分离得到的化合物大多具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节等活性[2-7]。而菌株产生次级代谢产物的能力，除了受合成该产物的基因种类和数量的制约外，与培养条件也密切相关[8]。同时研究证实，通过改变菌株的生长微环境（如培养基质、营养成分、湿度等）可激活菌株的“沉默代谢途径”，增加菌株次级代谢产物的多样性，从而提高菌种资源的利用率[9]。

OSMAC（one strain-many compounds）策略是提高菌株次级代谢产物产量和类别的有效手段[10-12]。Bode等[13]采用该法从6株微生物中获得了25类100余个化合物。谢绵测等[14]仅将烟曲霉培养基由酵母膏蛋白胨葡萄糖改变为麦芽琼脂，所获得的主要化合物便从1个提高到7个。液态发酵和固态发酵是微生物常用的2种发酵方式，不同的培养基质与培养方式对微生物代谢产物的产量以及类型都影响较大，杨宁[8]发现研究的35株放线菌在固态培养基质下共产生34种次级代谢产物，是液态发酵的2倍。Priyani等[15]发现Chaetomium chiwersii在同种培养基的液态培养中主要产生chaetochromin A，而在固态培养中则主要产生radicicol。因此，在研究内生真菌的次级代谢产物时，必须考虑不同的培养环境对菌株次级代谢产物合成水平的影响。

目前对内生真菌培养方式的研究，普遍做法是选用一种基础培养基，通过对其发酵条件（如接种量、发酵时间、温度、pH、添加剂等）进行探究，从而达到优化目的[16-17]。而菌株发酵时固态发酵常以静置方式、液态发酵则以静置及动态方式，但内生真菌在不同基质以及不同培养方式中其次级代谢产物合成水平的研究较少。同时本实验室前期研究发现，动态发酵合成的次级代谢产物总量少且种类有限[18-19]，且对某些内生真菌的发酵条件进行优化后，其发酵产物的增加不显著[20]。考虑到内生真菌原位生态环境供氧并不丰富的特点以及动态发酵应用的局限性，本研究拟选用实验室常用的几种真菌培养基对实验室保藏的一株丝状真菌进行发酵，通过对其次级代谢粗提物的总产量、所合成化合物的类别及其抗肿瘤细胞活性等几个方面进行效果评价，以寻求更合适的菌株发酵方式，为后续的进一步分离纯化、寻找关键活性物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种与标准品 内生真菌细极链格孢（Alternaria tenuissima）CH1307c，由本实验室分离自海南粗榧韧皮部。高三尖杉酯碱标准品（HHT），购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 癌细胞株 细胞K562（人慢性髓原白血病细胞），细胞NB4（急性早幼粒白血病细胞）购于中国典型培养物保藏中心；细胞HL60（人急性髓原白血病细胞）购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.3 试剂 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基购自北京索莱宝，细胞实验级；Iscoves modified Dulbecco medium（IMDM）培养基购自Gibco，细胞实验级；胎牛血清购自Hyclone，细胞实验级；3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide（MTT）购自Amresco，分析纯；乙酸乙酯、氯仿、二甲基亚砜、无水硫酸钠等均购自广州化学试剂厂，分析纯。

1.1.4 仪器与设备 电子精密天平PB303-N型，梅特勒-托利多仪；立式旋转蒸发仪RE-5203AA型，上海亚荣仪器设备有限公司；高压蒸汽灭菌锅YXQ SG41.280型，上海医用核子仪器厂；循环真空泵SHZ-D（III）型，上海隆拓仪器设备有限公司；超净工作台CSY-2型，上海净化设备厂；全自动酶标仪SynergyHT型，Bio-Tek；倒置显微镜CKX41SF型，OLYMPUS；全自动细胞计数器TC10型，bio-Red；双人单面超净工作台SW-CJ-2FD型，苏洁净化；CO2培养箱MCO-175型，SANYO；台式低速离心机TD5M型，长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.1.5 培养基 种子培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自来水1 000 mL，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

大米培养基：大米50 g、自来水25 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

麦麸培养基：麦麸20 g、自来水35 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃灭菌20 min，趁热摇散[21]。

马铃薯培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自来水1 000 mL，装液量100 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

细胞培养基：含10%胎牛血清的RPMI1640培养基；含20%胎牛血清的IMDM培养基。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 种子液制备：取经活化的CH1307c斜面菌丝一环至种子培养液中，于28 ℃ 115 r/min的摇床中培养至培养液中清晰可见密集菌丝球，备用。

大米固态发酵：取灭菌的大米培养基9瓶，每瓶接种2 mL的种子液，静置发酵30 d。

麦麸固态发酵：取灭菌的麦麸培养基9瓶，每瓶接种2 mL的种子液，静置发酵30 d。

马铃薯液态静置发酵：取灭菌的马铃薯培养基9瓶，取种子液以2%（V/V）的接种量接种，静置发酵30 d。

马铃薯动态发酵：取灭菌的马铃薯培养基9瓶，取种子液以2%（V/V）的接种量接种，于28 ℃ 115 r/min的摇床中培养至发酵液中布满菌丝球。

将以上4种发酵方式各设置3组平行试验，取不接种的各培养基进行空白对照试验。

1.2.2 发酵产物的提取 固态发酵培养物用乙酸乙酯以浸没分次萃取4次，液态发酵培养物用乙酸乙酯以1 ∶ 1分次萃取4次，静置萃取间隔12 h，合并4次有机萃取相，于40 ℃减压浓缩得浸膏，备用。

1.2.3 化学成分类别测定 将各待测样品制备后，采用试管法对各样品进行化学成分分析，根据各特定的颜色、沉淀等反应特征，判断该样品中可能含有的化合物类别[22]。

1.2.4 抗癌活性测定 准确称取标准品HHT以及4种发酵方式获得的次级代谢粗提物，用含DMSO（1%；V/V）的PBS溶液配制成系列浓度（1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL），备用。分别取对数生长期的各细胞株，将细胞K562、NB4用RPMI1640培养基分别配制成浓度4×104个/mL、6×104个/mL的细胞悬浮液，将细胞HL60用IMDM培养基配置成浓度1×105个/mL的细胞悬浮液；以每孔90 μL加至96孔培养板，于37 ℃的CO2（5%）培养箱中培养过夜；以每孔10 μL加入系列浓度的发酵提取液浸膏以及标准品HHT；继续培养2 d后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL；继续培养4 h后，加入三联液100 μL；过夜，于570 nm的波长下测定每孔吸光值；每板需设多个复孔的阳性对照以及阴性对照，每个浓度设置3个重复。按下式计算抑制率。并计算IC50值[23]。

抑制率（IR）=（1-待测样品OD570值/阴性对照OD570值）×100%

1.3 数据处理

采用SPSS 20软件对所得数据进行统计分析，结果以平均值±标准差（Mean±Sd）表示。

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式对内生真菌CH1307c次级代谢产物产量的影响

由表1可知，2种固态发酵：大米发酵及麦麸发酵所得粗提物产量分别为动态发酵的46.9倍及29.0倍，这可能是由于固态发酵更接近内生真菌生长的原生态，因此固态较液态的合成水平高。同时，对于该菌株大米较麦麸的产量高，说明该菌株在大米为基质的培养环境中合成水平较麦麸佳。使用液态发酵时，动态方式所得粗提物的产量为静置方式的9.1倍，这可能是由于静置发酵时菌丝只在培养液表面生长，无法充分利用营养物，而动态发酵虽然增加了溶氧量，但其菌体与培养基充分接触，从而发酵效率提高。本实验结果也表明，影响内生真菌次级代谢产物产量的因素包括供氧及菌株对培养基的利用率，且供氧的影响较大。

2.2 不同发酵方式对内生真菌CH1307c次级代谢产物化学成分类别的影响

由表2可知，对于固态发酵，大米发酵所得的粗提物7类检测项目皆为阳性，化合物类别最为丰富，而麦麸发酵所得粗提物中未检测到黄酮类化合物。对于液态发酵，动态方式所得粗提物除黄酮6项检测项目皆为阳性，化合物类别较静置方式更丰富，静置方式只含酚类、生物碱类、甾体类以及油脂类化合物。

定性实验虽无法准确判别该类化合物的存在与否，但未检出的化合物类别即使存在含量也较低，而低含量的化合物较难分离，不利于后续研究。对比4种发酵方式发现，大米发酵最能激发菌株的“沉默代谢途径”，提高菌株次级代谢产物的合成水平。因此，以化合物种类为指标，大米发酵最优。

2.3 不同发酵方式对内生真菌CH1307c次级代谢产物的抗癌活性影响

由表3的显著性分析结果表明，4种发酵方式获得的代谢粗提物对3种癌细胞的抑制增殖活性差异显著，这可能是由于在同浓度下4种发酵方式获得的粗提物在成分与类别上的差异，从而造成其抑制效果的不同。但据表4的IC50值可知，4种代谢粗提物对K562细胞的IC50值均大于100 μg/mL，即该菌株由4种发酵方式获得的次级代谢产物对K562未表现出抑制增殖活性；4种代谢粗提物对细胞NB4、HL60的IC50值均在30～40 μg/mL且并无明显差异，从IC50可知，由4种发酵方式获得的该菌株的次级代谢产物对NB4、HL60细胞均具有较好的抑制增殖作用，推测是由于4种发酵方式获得的代谢产物中，含有相同或相似的成分。实验结果说明，该菌株由4种发酵方式得到的代谢粗提物含有抑制急性白血病细胞增殖的活性成分，具体机制有待进一步研究。

3 讨论

本研究结果表明，4种发酵方式所获得的菌株CH1307c的次级代谢产物对3株白血病细胞的IC50值无明显差异，说明这4种发酵方式不影响该菌株次级代谢产物对3种白血病细胞的抑制增殖作用。但大米及麦麸固态发酵获得的代谢产物，在产量及化合物类别上均显著优于马铃薯液态发酵。而本实验室前期通过对高活性的海南粗榧内生真菌F7进行动态发酵，60 L的发酵液只获得了11.6 g的次级代谢产物浸膏[24]；阳晖蓉通过对海南粗榧内生真菌F127进行动态发酵，70 L的发酵液只获得15.6 g的次级代谢产物浸膏[25]；本研究获得的产量显然极显著地提高了内生真菌次级代谢产物的合成水平。这可能是由于液态发酵会抑制该菌株的生化代谢，不利于次级代谢产物的合成，而固态培养的微环境更接近于内生真菌生长的原生态，因此更有利于次级代谢产物的积累及化合物种类的多样性[8]。同时，在工业生产中，液态发酵因所需设备体积大、费用高且易污染等因素限制了其的应用，然而固态发酵能克服上述不足。因此，固态发酵可作为提高该菌株次级代谢产物产量和多样性的有效手段。

在本研究中，大米固态发酵获得的次级代谢产物产量最高且化合物种类最丰富，因此，可选用大米固态发酵对该菌株进行大规模发酵，从而提高该菌株的菌种利用率。同时，本研究的结果也表明，选用合适的培养方式能显著提高次级代谢产物的合成水平，该探索方法同样也适用于其它内生真菌，这对提高内生真菌菌种资源的利用率有重要意义。另外，由于该菌株对NB4、HL60细胞表现出良好的抑制作用，今后将进一步对其抗癌活性的成分进行分离纯化。

参考文献

[1] Petrini O. Fungal endophytes of tree leaves[M]. Cambridge： Cambridge University Press， 1991： 185-187.

[2] Liang-Liang Z， Yi-Ming L， Hai-Chao Z， et al. Condensed tannins from mangrove species Kandelia candel and Rhizophora mangle and their antioxidant activity[J]. Molecules， 2010， 15（1）： 420-431.

[3] Jixing P， Tao L， Wei W， et al. Antiviral alkaloids produced by the mangrove-derived fungus Cladosporium sp. PJX-41.[J]. Journal of Natural Products， 2013， 76（6）： 1 133-1 140.

[4] Li Y， Bao L， Song B， et al. A new benzoquinone and a new benzofuran from the edible mushroom Neolentinus lepideus and their inhibitory activity in NO production inhibition assay[J]. Food Chemistry， 2013， 141（3）： 1 614-1 618.

[5] 李 想， 孙光芝， 郑毅男， 等. 红树植物内生真菌Penicillium sp.中两个甾体化合物的研究[J]. 天然产物研究与开发， 2007， 19： 420-422.

[6] Rayburn E R， Ezell S J， Zhang R. Anti-Inflammatory Agents for Cancer Therapy[J]. Molecular & Cellular Pharmacology， 2009， 1（1）： 29-43.

[7] Chang R W， Ng T B， Le L， et al. Isolation of a polysaccharide with antiproliferative， hypoglycemic， antioxidant and HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activities from the fruiting bodies of the abalone mushroom Pleurotus abalonus[J]. Journal of Pharmacy & Pharmacology， 2011， 63（6）： 825-832.

[8] 杨 宁. 固态培养法增加微生物次级代谢产物的多样性[D]. 大连： 大连理工大学， 2013.

[9] Kieser T， Bibb M J， Buttner M J， et al. Practical streptomyces genetics[M]. John Innes Foundation Norwich， UK， 2000.

[10] Goodfellow M， Fledler H. A guide to successful bloprospecting：Informed by actinobacterial systematics[J]. Antonie van leeuwenhoek， 2010， 98（2）： 119-142.

[11] Hewage R T， Aree T， Mahidol C， et al. One strain-many compounds（OSMAC）method for production of polyketides， azaphilones， and an isochromanone using the endophytic fungus Dothideomycete sp.[J]. Cognitive & Behavioral Practice， 2007， 14（1）： 98-106.

[12] Zhang Q， Wang S Q， Tang H Y， et al. Potential Allelopathic Indole Diketopiperazines Produced by the Plant Endophytic Aspergillus fumigatus using OSMAC method.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2013， 61（47）： 11 447-11 452.

[13] Bode H B， Bethe B， Hofs R， et al. Big effects from small changes： possible ways to explore nature's chemical diversity[J]. ChemBioChem， 2002， 3（7）： 619-627.

[14] 谢绵测， 李先国， 张大海. OSMAC策略及其在烟曲霉菌次级代谢产物研究中的应用[J]. 天然产物研究与开发， 2015， 27： 1 668-1 673.

[15] Priyani A， Paranagama E M， Kithsiri W， et al. Uncovering biosynthetic potential of plant-associated fungi： effect of culture conditions on metabolite production by Paraphaeosphaeria quadriseptata and Chaetomium chiwersii[J]. J Nat Prod， 2007， 70（12）： 1 939-1 945.

[16] 苗莉云， 张 鹏， 周蓬蓬， 等. 产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件优化[J]. 微生物学通报， 2013， 40（6）： 132-132.

[17] 李信军， 冯晓晓， 金慧清， 等. 两株内生真菌菌株固态发酵培养基优化[J]. 微生物学通报， 2016， 43（3）： 550-558.

[18] 吴延春. 海南粗榧内生真菌抗菌活性及次级代谢产物研究[D]. 海口： 海南大学， 2014.

[19] 阳晖蓉. 海南粗榧内生真菌次级代谢产物及其抗菌抗肿瘤活性研究[D]. 海口： 海南大学， 2015.

[20] 刘 艳， 刘四新， 李永成， 等. 海南粗榧内生真菌细极链格孢CH1307产高三尖杉酯碱的发酵条件[J]. 热带生物学报， 2012， 32（3）： 236-242.

[21] 林亲录， 赵谋明， 邓 靖， 等. 毛霉产蛋白酶的特性研究[J]. 食品科学， 2005， 26（5）： 44-47.

[22] 肖崇厚. 中药化学[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 2002.

[23] 蒋春洁， 李从发， 阳辉蓉， 等. 海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选[J]. 江苏农业科学， 2015（2）： 329-331.

[24]阳晖蓉. 海南粗榧内生真菌次级代谢产物及其抗菌抗肿瘤活性研究[D]. 海口： 海南大学， 2015.

[25]吴延春. 海南粗榧内生真菌抗菌活性及次级代谢产物研究[D]. 海口： 海南大学， 2014.