广西毛葡萄产区野生葡萄酒酵母种群分布与系统进化分析

杨莹 管敬喜 谢林君 张劲 文仁德 成果

摘要：【目的】对广西毛葡萄产区野生葡萄酒相关酵母菌的种类进行鉴定及分布研究，明确毛葡萄产区主要酵母种类及分布规律，为当地酿酒酵母资源的开发利用打下基础。【方法】从葡萄果实表面和果实自然发酵汁中分离、纯化野生葡萄酒相关酵母，利用WL培养基对分离获得的酵母菌株进行分类，从每一类型中选取代表菌株进行26S rDNA 基因测序鉴定并进行系统进化分析。【结果】从葡萄果实表面及自然发酵汁中共分离获得180株酵母菌株，根据菌株在WL培养基上的颜色及菌落形态差异将180株酵母菌归为5类。26S rDNA基因序列分析结果表明，20株代表菌株分属于6个属9个种，分别为：汉逊酵母属的Hanseniaspora thailandica、H. opuntiae、H. occidentalis和H. guilliermondii；毕赤酵母属的Pichia pastoris；伊萨酵母属的Issatchenkia terricola；酿酒酵母属的Saccharomyces cerevisiae；Saturnispora属的S. diversa和红酵母属（Rhodutorula，未鉴定到种）。葡萄汁自然发酵过程中由H. thailandica启动发酵， 随后出现H. thailandica、H. opuntiae、H.occidentalis、H. guilliermondii和S. diversa，最后由S. cerevisiae逐渐主导并控制发酵。【结论】在广西都安县毛葡萄产区生态环境中存在6个属9个种的葡萄酒相关酵母菌，其中H. guilliermondii是毛葡萄果表优势酵母菌种；在毛葡萄自然发酵汁中存在汉逊酵母的4个不同种及S. diversa和S. cerevisiae，随着发酵环境的变化此消彼长。

关键词： 毛葡萄；葡萄酒相关酵母；种群分布；系统发育进化树；广西都安县

中图分类号： Q938.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1123-06

0 引言

【研究意义】葡萄酒相关酵母是指在葡萄生长和种植区域的自然环境中存在的与葡萄酒生产相关的酵母菌种，具体包括非酿酒酵母属及酵母属的一些种。迄今为止，在葡萄果表、葡萄汁及葡萄酒厂中发现的酵母菌已有24个属120个种，几乎遍及酵母的主要属种，这些酵母菌由于长期存在于特定的自然条件及环境中，在繁衍过程中逐步适应当地的品种特点、气候条件及土壤特征，从而获得了有别于其他地域的代谢特征。这些具有本土特征的酵母菌在葡萄酒发酵过程中会带给葡萄酒独特的感官和风味，赋予葡萄酒独有的地域特征（Dubourdieu et al.，2006；Christian et al.，2007）。因此，利用本土酵母是解决目前国内葡萄酒质量趋同、风格单一的有效办法；同时，调查研究本土野生酵母菌的种类和分布进化规律，是开展野生酿酒酵母筛选、改良及加工应用工作的基础。【前人研究进展】自1860年巴斯德发现酒精发酵是由酵母菌的作用而产生以来，人类对酵母的利用及研究就从未间断。Harry等（2003）对葡萄及葡萄园中酵母种群结构的研究结果表明，汉逊酵母属（Hanseniaspora）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、红酵母属（Rhodotorula）和克鲁维酵母属（Kluyveromyces）是存在于葡萄园中的优势菌种。Torija等（2001）连续3年观察西班牙普里奥拉托和特拉阿尔塔葡萄酒产区葡萄自然发酵种酵母种群变化，发现非酿酒酵母属的星型假丝酵母（Candida stellata）、软假丝酵母（Candida colliculosa）、葡萄汁有孢汉逊酵母（H. uvarum）、拜耳接和酵母（Zygosaccharomyces bailii）和美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）在发酵前期占主导地位，但在发酵中后期酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是主导酵母。Harry等（2003）研究了美国俄亥俄州伊利湖地区葡萄自然发酵中的酵母种群，指出柠檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）和葡萄汁有孢汉逊酵母（H. uvarum）是存在于本土的主要菌種，其次是梅氏酵母（Metschnikowia）、假丝酵母（Candida）、毕赤酵母（Pichia）、汉逊酵母（Hansenula）。Rementeria等（2003）和Belén Suáre等（2007）研究發现，在葡萄汁的自然发酵过程中，非酿酒酵母属的菌种由于对酒精耐受的生理特性不同，此消彼长，最终逐步被酿酒酵母（S.cerevisiae）所替代；同时，Pretorius（2000）指出，S. cerevisiae几乎从未从健康果实表面和葡萄园土壤中分离得到。S. cerevisiae在葡萄上没有发现，但存在于酒厂设备上。随着阿根廷、智利等葡萄酒新世界国家的兴起，这些地区也越来越重视本土酵母种群的研究和应用。Mercado和Combina（2010）研究了阿根廷酿酒葡萄园中酿酒酵母的基因多样性，从自然发酵的葡萄汁中分离出商业酵母菌株，指出商业酵母已普遍存在于葡萄园生态中。巴西学者Milla等（2011）分离鉴定了本土葡萄园的葡萄酒相关酵母，发现H. uvarum、东方伊萨酵母（Issatchenkia occientalis）是当地的优势菌种，同时还分离到S. cerevisiae、出芽短梗霉（类酵母）（Aureobasidium pullulans）和锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）。Díaz等（2013）在智利的葡萄自然发酵汁中分离鉴定出9个种的酵母菌，并发现美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、毕赤克鲁维酵母（P. kluyveri）、毕赤膜酵母（P. mem-

branifaciens）及S.cerevisiae在发酵末期仍然存在。近10年来我国也陆续开展了不同产区酿酒微生物的生态调查及品种鉴定研究。刘爱国等（2008）、王泽举等（2008）、王国平等（2009）、孙卉卉等（2009）从不同产区分离鉴定出的葡萄酒相关酵母菌种大致相同，但不同地区，特别是气候类型差异较大的地区酿酒微生物种群存在较大差异。【本研究切入点】目前，国内外对葡萄酵母群落的研究主要集中在人工管理种植的葡萄园中，对于野生葡萄生态环境中酵母菌群落的研究报道很少。广西都安是中国野生毛葡萄起源地之一，据调查都安县现有野生毛葡萄60261株，覆盖面积达234.5 ha（3517畝）（王甲佳，2009；吴代东等，2015），且野生毛葡萄生长区相对封闭，地域特征明显，因此，当地应存在丰富的葡萄酒酵母资源及相对独立的酵母进化发展历程。【拟解决的关键问题】通过对广西毛葡萄产区野生葡萄酒相关酵母种类的调查研究及进化分析，探明存在于毛葡萄起源地区葡萄酒相关酵母的主要种类及分布规律，初步探索该地区葡萄酒相关酵母进化进程，为当地酿酒酵母资源的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试葡萄浆果采集于广西河池市都安瑶族自治县青盛乡树龄50年以上的野生毛葡萄植株。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 果表酵母分离 在葡萄成熟期（8月31日～

10月6日）采集葡萄浆果，将果粒置于灭菌生理盐水中振荡10 min，将溶有酵母菌的生理盐水稀释至适当梯度（10-4～10-2），取1.0 mL，涂布于YPD培养基（加氯霉素100 mg/L以抑制细菌生长）上，28 ℃富集培养2～3 d，记录菌落形态特征、菌落个数，然后挑取单个菌落，以划线方式在YPD培养基上分离纯化。

1. 2. 2 自然发酵汁酵母分离 将成熟果粒破碎，带皮进行自然发酵。自然发酵汁分别采用40 mg/L SO2处理和不加SO2处理，待发酵启动后，每天取1.0 mL发酵液（连续8 d），稀释至适当梯度（10-3～10-4），涂布于YPD培养基，28 ℃富集培养2～3 d，随机挑取单个菌落10～15个（选取计数的培养皿菌落应控制在30～300个），以划线方式在YPD培养基上分离纯化。28 ℃培养箱中富集培养72 h。

1. 2. 3 菌株保藏 将纯化后的单菌株在YPD液体培养基中活化1 d，将活化的菌液与30%无菌甘油以1∶1混合于1.5 mL离心管中，-70 ℃下保藏。

1. 2. 4 WL营养琼脂聚类分析 采用WL培养基对收集到的酵母菌株进行初步分类：将保藏的菌株活化后划线接种于WL营养琼脂培养基，28 ℃培养5 d后， 观察记录菌落的颜色和形态，根据菌落不同表现特征对菌株进行初步归类（Cavazza et al.，1992）。

1. 2. 5 代表菌株26S rDNA D1/D2区序列扩增及测定 采用石英砂破壁法提取菌株总DNA。挑取YPD培养基上生长良好的单菌落于200 μL的裂解液中（50 mmol/L Tris-HCI，180 mmol/L EDTA，1%SDS），加入3/10体积的石英砂振荡15～18 min；65 ℃水浴10 min，加200 μL 3 mol/L醋酸钾冰浴8 min，14000 r/min离心5 min，取上清液；加入3 mol/L醋酸钠35 μL、异丙醇200 μL，冰浴8 min，14000 r/min离心5 min，收集沉淀；用200 μL TE溶解沉淀，加入10 μL RNA酶，65 ℃水浴10 min；取上清液，加0.1倍体积的3 mol/L醋酸钾及375 μL无水乙醇，以最大速离心8 min，收集DNA；70%乙醇洗涤，离心，抽干；加50 μL TE溶解。

26S rDNA D1/D2 PCR扩增：扩增引物为26S NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。使用TAKARA

MightyAmp DNA Polymerase Ver.2（R071Q）进行PCR扩增。PCR反应体系（50.0 μL）：2×MightyAmp Buffer Ver.2 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol），MightyAmp DNA Polymerase 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 21.0 μL。擴增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，进行30个循环，4 ℃保存。

1. 2. 6 测序分析 PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果查询GenBank数据库，采用BLAST在线工具进行相似性比较。

1. 2. 7 葡萄汁自然发酵前后酸度测定 采用酸碱滴定法进行测定。

2 结果与分析

2. 1 野生菌株的WL聚类分析及测序鉴定结果

分别从果实表面及自然发酵汁中收集到50和130株酵母菌株。将收集到的180株酵母菌重新活化，涂布于WL培养基上，根据菌株在WL培养基上的颜色及菌落形态差异将180株酵母菌归为5类，具体菌落特征描述见表1。不同菌种在YPD培养基上的形态特征见图1。

根据WL培养基聚类分析结果，分别从5个类型菌株中挑选代表菌株，共挑选20株菌株进行26S rDNA D1/D2基因序列分析。测序结果查询GenBank数据库，采用BLAST在线工具进行相似性比较。测序鉴定结果表明，20株代表菌株分属于6个属9个种，分别是汉逊酵母属的H.thailandica、H.opuntiae、H.occidentalis和H.guilliermondii；毕赤酵母属的P. pastoris；伊萨酵母属的I. terricola；酿酒酵母属的S.cerevisiae；Saturnispora属的S. diversa和红酵母属（Rhodutorula，未鉴定到种）。

2. 2 葡萄浆果表面野生酵母种类分布情况

从果表采集到的50株菌株中选取30株代表菌株进行聚类分析，结果发现，30株菌株分属于4个属的4个种，分别是季也蒙有孢汉逊酵母（H. guilliermondii）、东方伊萨酵母（I. terricola）、巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）和红酵母（Rhodutorula），分别占果表分离菌总数的61.53%、23.07%、7.70%和7.70%。

2. 3 自然發酵过程中野生酵母种类及动态变化

对毛葡萄自然发酵过程中菌种变化的监测发现，最初由汉逊酵母（H. thailandica）启动发酵。自然发酵前2 d只分离得到一种菌落形态的酵母菌，从自然发酵第2 d起分离出不同种的汉逊酵母，包括H. thailandica、H. opuntiae、H. occidentalis和H. guilliermondii，同时还分离得到S. diversa；到发酵第5 d开始分离出少量酿酒酵母（S. cerevisiae），随后S. cerevisiae比例增多，第8 d分离出的全部为S. cerevisiae（图2）。在整个发酵过程中共分离出汉逊酵母属、Saturnispora属及酿酒酵母属，其中汉逊酵母属有4个种均出现在发酵汁中。

2. 4 代表菌株测序结果及种群系统进化分析结果

选取12个菌株的26S rDNA序列采用ML分析法构建系统发育进化树，系统进化分析树状谱如图3所示。

由图3可知，12个菌株可分为4个遗传类群。第1分支中包括MSF6-1、MSF6-6、MSF1-4和MG3，其中前3种为同一种菌（H. thailandica），在系统发育进化树中也表现出其同种可靠性为100%，MG3为伊萨酵母（I. terricola），表明MG3与MSF6-1、MSF6-6和MSF1-4有较近的同源关系。第2分支中包括MSF8-1、MG4、MG7和MSF1-6，其中后3個菌株为同一种菌（H. guilliermon-

dii），MSF8-1为酿酒酵母（S. cerevisiae）；第3分支包括MSF6-2、MG2和MG6，测序结果表明3个菌株为汉逊酵母属下的3个不同种，分别为H. occidentalis、 H. thailandica和H. opuntiae；最后一个分支MG1为毕赤酵母属的P. pastoris。

按遗传距离分析，第1分支和第4分支遗传距离较长，第2分支和第3分支遗传距离较短，表明在这些菌株的进化过程中，第2、第3分支进化地位较古老，第1、第4分支进化地位较新。

3 讨论

3. 1 广西毛葡萄产区野生酵母菌生态分布

本研究中分离出的野生毛葡萄果实表面酵母菌种类与国内外大部分研究结果一致，主要为汉逊酵母、毕赤酵母、伊萨酵母及红酵母，但未分离得到葡萄园常见的Candida酵母属、Metschnikowia和kloeckera等葡萄酒相关酵母。长期的研究结果表明，葡萄园的酵母菌种类与气候、土壤、环境及葡萄园管理密切相关。Torija等（2001）连续3年观察西班牙普里奥拉托和特拉阿尔塔葡萄酒产区葡萄自然发酵种酵母种群变化，指出酵母群的种类与地理气候条件有关，每年都有微小的变化，但与葡萄酒类型、起源及分离年份无关。焦红茹（2008）通过对不同品种葡萄相关酵母的分离与分类鉴定也发现，不同种葡萄表面酵母分布与发酵汁中酵母变化大同小异。由此说明气候及生态环境是影响酵母种群分布的主要因素。本研究中供试材料来源于广西都安毛葡萄产区，该地区是典型的喀斯特岩溶地貌山区，属亚热带季风气候区，夏季高温高湿，冬季干旱少雨，与其他产区相比具有明显差异。从本研究中分离出的果表酵母种类较少，且在种上也与其他研究结果有一定差别。

3. 2 自然发酵过程中酵母菌的种类及变化

本研究在自然发酵过程中共分离获得3个属的6种酵母菌，分别为汉逊酵母属的H. guilliermondii、H. thailandica、H. occidentalis、H. opuntiae，Saturnispora属的S. diversa和酿酒酵母属的S. cerevisiae。由H. guilliermondii启动发酵，随后出现同属的其他种，到发酵中后期由S. cerevisiae逐渐主导并完全控制发酵。而在新疆、甘肃及河北等产区的自然发酵葡萄汁中占主导的菌种为H. uvarum，同时在发酵初期普遍分离得到M. pulcherrima、H. uvarum、P. kluyverivar和I. orientalis等菌种（刘爱国等，2008；王泽举等，2008；孙卉卉等，2009；王国平等，2009）。在本研究中分离到的S. diversa菌为国内首次报道，该菌主要分布在热带地区，曾在印度尼西亚（Uchiyama et al.，1995）、巴西（Morais et al.，2005）的热带雨林被分离到。

毛葡萄具有糖低酸高的显著特点（邹瑜等，2012；陈洁梅等，2014），对一些种酵母具有选择淘汰作用。为初步判定毛葡萄生境中野生酵母是否具有代谢酸的特征，本研究检测了发酵汁前后的总酸值。本研究中发酵初期的葡萄汁酸度为28.35 g/L，自然发酵结束后发酵汁总酸降为25.70 g/L，酸度降低了2.65 g/L；同时，果表酵母中除H. guilliermondii外，其他菌株均未在发酵汁中出现，而S. cerevisiae在自然发酵后期出现并占主导地位。可见，汉逊属酵母对葡萄汁酸度具有较高的耐受性，S. cerevisiae可能具有较强的酸代谢能力。

3. 3 广西都安野生葡萄酒酵母菌系统进化关系

本研究中分离出的与发酵密切相关的汉逊酵母、毕赤酵母、伊萨酵母和酿酒酵母的12株酵母菌可分为4个遗传类群，4个不同种的汉逊属酵母位于3个不同分支上，其中同属于汉逊酵母属的H. thailandica与其他分离出的汉逊属酵母不在同一分支上，但与MG3（I.terricola）具有较近的亲缘关系。本研究中的S. cerevisiae与H. guilliermondii在同一分支上，具有较近的亲缘关系，同时该两种菌株均为发酵过程中的优势菌种。因此，对于广西野生毛葡萄产区的葡萄酒相关酵母的种间关系及遗传起源还应进行更深入的研究。

4 结论

本研究通过对广西野生毛葡萄产区生态环境中葡萄酒相关酵母种类的调查及分类鉴定，共分离得到6个属9个种的葡萄酒相关酵母，分别为汉逊酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、酿酒酵母属、红酵母属及Saturnispora属，其中浆果表面分离得到H. guilliermondii、P. pastoris、I. terricola和Rhodutorula，H. guilliermondii为葡萄果表优势种；从自然发酵汁中分离得到汉逊酵母属的4个不同种、Saturnispora属和酿酒酵母，由汉逊酵母H. thailandica启动发酵，最后由S. cerevisiae主导并控制发酵；发酵汁中的汉逊酵母具有较强的耐酸及嗜酸能力。

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（責任編辑 麻小燕）