‘红肉蜜柚’果实汁胞粒化与不同组分POD活性的关系

徐世荣　潘鹤立　吴嘉玲　宋敏娜　李小婷　张智伟　余磊　潘东明

摘 要 为了研究‘红肉蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck. cv. Hongrou miyou]果实汁胞粒化过程中不同结合态过氧化物酶（POD）的变化，以及赤霉素处理对此的影响。以赤霉素处理和未经赤霉素处理的‘红肉蜜柚果实的近中柱和远中柱汁胞为材料，统计粒化指数后，进行POD提取体系筛选与酶活测定。发现‘红肉蜜柚果实汁胞粒化指数逐渐上升，有无赤霉素处理无明显变化；可溶性POD最佳提取体系为pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl的缓冲液；离子结合POD的为含0.1% Triton和1 mol/L NaCl的pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液；未检测到共价结合POD活性。此外，可溶性、离子结合POD活性在生长发育过程中整体呈下降趋势，且无论是否经赤霉素处理，近中柱与远中柱汁胞的可溶性POD活性均存在极显著差异（p<0.01），而离子结合POD活性均无显著差异（p>0.05）；无论近中柱或远中柱，有无赤霉素处理的可溶性POD均存在极显著差异（p<0.01），而离子结合POD活性仅在远中柱汁胞中有极显著差异（p<0.01）。所以，可溶性POD可能与汁胞粒化关系密切，而离子结合、共价结合POD和赤霉素对汁胞粒化的影响有待进一步研究。

关键词 ‘红肉蜜柚；粒化；POD活性；赤霉素

中图分类号 S666.3 文献标识码 A

Abstract To test the variation of different combined peroxidase（POD）during juice sac granulation in‘Hongroumiyou[Citrus grandis（L.）Osbeck. cv. Hongrou miyou]， and to investigate the influence of gibberellin（GA）on this process， the fruits of‘Hongroumiyousampled from normal and GA-treated plants were used as the models in this study， which were taken to calculate granulation index， and their juice sac near and away from the vascular cylinder were sampled to determine POD extraction and enzyme activity. The results showed that， the juice sac granulation index of‘Hongroumiyoushowed a rise. The treatment of GA did not significantly influence such variation pattern. pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl and pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl containing 0.1% Triton X-100 and 1 mol/L NaCl were established as the optimal extraction buffer for soluble and ion-bound POD， respectively. But， the covalently-bound POD was not extracted. The whole activities of soluble and ion-bound POD were both falling during growth and development process. The soluble POD activities between juice sacs close to the stele and away from the stele had significant difference（p<0.01）in normal and GA-treated fruits， and which between normal to GA-treated fruits also had significant difference（p<0.01）in juice sacs close to the stele and away from the stele， while the ion-bound POD activities had significant difference（p<0.01）in away from the stele. Therefore， soluble POD was significantly related to the process of juice sac granulation， However， the influence of ion-bound POD， covalently-bound POD and GA on juice sac granulation requires further investigation.

Key words ‘Hongroumiyoupummelo； Granulation； Activity of POD； Gibberellin

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.008

柚[Citrus maxima （Burm.） Merr.]是我国最重要的经济果树之一，因其果实硕大，果肉香甜且富含对人体有益的维生素C、黄酮等成分而享誉世界[1]。但发生在果实发育和采后贮藏阶段的汁胞粒化现象（见图1）对其食用品质和商品价值造成了严重影响[2]。因此，柚汁胞粒化问题的研究对于柚产业的可持续发展具有重大意义。

目前关于柚生长发育过程中所发生的汁胞粒化现象，佘文琴[3]已从形态解剖学、生物学特性、生理生化和分子生物学角度进行了研究，但还未能阐明粒化的产生机制。本课题组的前期研究中发现木质素代谢与柚汁胞粒化密切相关，POD是木质素形成过程中的一个关键酶，能催化木质素前体发生氧化聚合反应形成复杂的木质素聚合物[4]。而且柚汁胞中木质素积累与活性氧（H2O2）含量的显著增加有关[5]，POD又是活性氧代谢中重要的活性氧清除酶之一。由此可见，POD与汁胞粒化的发生关系密切，且植物体内的POD主要以可溶态、离子结合态、共价结合态3种形式存在[6]，因此本研究从木质素代谢途径入手，以粒化较为严重的‘红肉蜜柚汁胞为实验材料，对参与木质素前体氧化的3种不同形态POD建立最优提取体系并对果实发育过程中POD酶活进行相关分析，以期找出其与粒化的相关性。此外，还有研究表明，在柚果实膨大时期进行赤霉素喷洒会加速果实粒化进程[7]。为此，本研究对部分试验果树喷布赤霉素作为对比，统计其粒化指数的变化并观察其对不同形态POD活性的影响，以期为后续汁胞粒化机制的研究提供更多有用的信息，从而解决生产上柚果实汁胞粒化的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘红肉蜜柚果实来源于福建漳州平和县，果实采摘于盛花期后95～211 d，这其间，对部分‘红肉蜜柚树于127 d进行50 mg/L赤霉素处理。每个时期的样品具备3个生物重复，每个生物重复由3个不同生长部位的果实混果而成。参照佘文琴[3]的方法进行粒化指数观测记录（见图2）后，将各果实靠近中柱（近中柱）和靠近海绵层（远中柱）的汁胞分别取下，用液氮处理后存放在超低温冰箱中（-80 ℃）备用。

1.1.2 试剂与设备 Tris（分析纯）、Triton X-100（优级纯）、30% H2O2（优级纯）、NaCl（优级纯）、NaH2PO4（优级纯）、Na2HPO4（优级纯）、赤霉素（Gibberellic acid mix，生工，优级纯）、浓盐酸（分析纯）、愈创木酚（优级纯）、双蒸水（ddH2O）、石英砂等。

涡旋仪（MX-S）、恒温摇床（ZWY-240）、恒温循环水浴装置（HH-501）、紫外可见分光光度计（TU-1901）、台式高速冷冻离心机（Allegra X-22）、小型研钵、10 mL离心管、移液枪等。

1.2 方法

1.2.1 可溶性POD提取体系筛选 取1 g左右的汁胞样品，按表1 A～L 12种缓冲液组合（缓冲液事先于冰上预冷）于冰上小型研钵中加入少量石英砂进行研磨，固液比为1 ∶ 4（先用2 mL进行研磨，再用1 mL洗涤2次）。研磨结束后将样品彻底转移到10 mL离心管中，彻底涡旋，4 ℃、15 000 ×g离心10 min，取上清进行酶活测定并记录上清总体积。每个组合重复4次，全程在4 ℃条件下进行。

1.2.2 离子结合POD提取体系筛选 用上述筛选出的最优可溶性POD提取缓冲液（pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液）按上述方法提取可溶性POD，并将沉淀物中的可溶性POD洗至没有活性后，加入分别含0.1% Triton X-100、1 mol/L NaCl、 （0.1%

Triton X-100+1 mol/L NaCl）、 （0.1% Triton X-100+

10% glycerin）、（1 mol/L NaCl+10% glycerin）、（0.1%

Triton X-100+1 mol/L NaCl+10% glycerin）、 （0.1%

Tweens+1 mol/L NaCl）、（0.1% CTAB+1 mol/L NaCl）的pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液。参照王蓓[8]的方法，进行彻底涡旋，于16 ℃恒温摇床中280 r/min振荡1 h，4 ℃、15 000 ×g离心10 min，取上清进行酶活测定并记录上清总体积。每个组合重复4次，全程在4 ℃条件下进行。

1.2.3 共价结合POD活性测定 用上述优化的最佳缓冲液提取离子结合POD后，将沉淀物中的离子结合POD洗至没有活性，再用pH5.5，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤3次。参考García-Gómez等[9]的方法，加入含0.5%（p/v）纤维素酶、2.5%（p/v）果胶酶的pH5.5，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液4 mL，于20 ℃恒温摇床中300 r/min振荡5 h，4 ℃、15 000 ×g离心10 min，取上清进行酶活测定并记录上清总体积。每份样品重复4次。

1.2.4 汁胞各发育时期POD酶活测定 参考Venkatachalam等[10]的方法，用上述优化后的最佳缓冲液提取汁胞各发育时期不同部位的POD后，按表2的体系组分配比于25 ℃、470 nm测定并记录1 min内的吸光值变化。单位鲜重的样品每分钟变化0.01个吸光值定义为一个酶活力单位，即：

1 U=ΔA470/（g FW·min）

1.3 数据处理

数据使用SPSS 19.0软件及Excel 2010进行分析。

2 结果与分析

2.1 可溶性POD提取体系筛选

提取缓冲液的组分、浓度及pH值对所提取的可溶性POD酶活力有一定的影响，为获得具有较高酶活力的‘红肉蜜柚可溶性POD，以便于后期研究，本试验对可溶性POD提取体系进行初步筛选。由图3可以看出，在所测试的3个因素的组合中，pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl提取体系获得的可溶性POD活性最高，因此，将该提取体系用于‘红肉蜜柚汁胞可溶性POD的提取。

2.2 离子结合POD提取体系筛选

关于柚汁胞中的离子结合POD尚未有研究报道，为获得具有较高酶活力的离子结合POD，以便对其进行后续研究，本试验对离子结合POD提取体系进行初步的筛选。由图4可知，缓冲液中不同添加剂对离子结合POD的提取效果差异很大。0.1% Triton和1 mol/L NaCl单独添加或在单独添加的基础上均添加10%甘油提取效果都较差，而0.1% Triton和1 mol/L NaCl一起使用则提取效果显著提高，但其添加10%甘油后则效果不佳，此外，将去垢剂Triton换成Tweens或CTAB后，提取效果均不如Triton。因此，本试验选用添加0.1% Triton和1 mol/L NaCl的pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl作为柚汁胞离子结合POD的提取体系。

2.3 共价结合POD活性测定

关于柚汁胞中共价结合POD的研究也未见报道。在预试验中分别取盛花期后107、137、170和191 d的样品进行共价结合POD活性测定，结果均未能检测，可能柚汁胞中确实不存在共价结合POD，或因0.1% Triton+1 mol/L NaCl提取过程较剧烈，导致共价结合POD失活。

2.4 汁胞各生长发育时期POD活性测定

由图5可知，未经赤霉素处理与经赤霉素处理的可溶性POD活性在生长发育过程中整体均呈下降趋势，且经赤霉素处理后的近中柱、远中柱汁胞可溶性POD活性均比未经赤霉素处理的低。通过配对样本T检验发现，未经赤霉素处理的近中柱与远中柱汁胞的可溶性POD活性存在极显著差异（p<0.01），经赤霉素处理后的近中柱与远中柱汁胞的可溶性POD活性也存在极显著差异（p<0.01）；且有无赤霉素处理的近中柱汁胞可溶性POD活性存在极显著差异（p<0.01），有无赤霉素处理的远中柱汁胞可溶性POD活性也存在极显著差异（p<0.01）。

如图6所示，未经赤霉素处理与经赤霉素处理的离子结合POD活性在生长发育过程中整体亦呈下降趋势，同可溶性POD相比，活性较低，与其存在极显著差异（p<0.01）。配对样本T检验显示，未经赤霉素处理的近中柱与远中柱汁胞的离子结合POD活性无显著差异（p>0.05），经赤霉素处理后的近中柱与远中柱汁胞的离子结合POD活性也无显著差异（p>0.05）；且有无赤霉素处理的近中柱汁胞离子结合POD活性同样无显著性差异（p>0.05），但是，有无赤霉素处理的远中柱汁胞离子结合POD活性却有极显著性差异（p<0.01）。

3 讨论

从研究结果可以看出，根据结合形态，‘红肉蜜柚果实汁胞中POD主要以可溶性和离子结合状态存在，在生长发育过程中，伴随粒化指数的升高，汁胞中的可溶性POD活性整体呈下降趋势，与佘文琴[3]的研究相一致。近中柱与远中柱可溶性POD活性的极显著差异表明POD可能与汁胞粒化密切相关，而赤霉素的处理使可溶性POD活性与未处理的也出现了极显著的差异，说明赤霉素可能对汁胞粒化有一定的影响。但是，赤霉素处理后近中柱与远中柱汁胞的可溶性POD活性均降低，且从汁胞粒化指数的最终结果来看，赤霉素处理与未经处理的相比，其粒化指数较低但是并无显著性差异，其粒化的进程也并未提前或者变快。这一结果与前人的研究结果[11]并不一致，可能是由于对试验果树果实赤霉素喷布的次数过少和喷布时的天气过于炎热，导致果面水分迅速蒸发使得溶解其中的赤霉素未能充分地运输到果实内部有关。因此，赤霉素处理对粒化的具体作用有待进一步研究。

此外，木质素代谢的相关研究还表明，木质素的氧化反应及聚合过程均发生于细胞壁上[4，12]，所以细胞壁上的离子结合态POD可能和粒化的关系更为密切，但目前关于粒化过程中的离子结合态POD却未见研究报道。可是，从本试验离子结合POD的酶活结果可知，其变化上并未显示出与粒化的相关性，且其酶活性较可溶性POD低很多，近、远中柱也未表现出显著性差异，只是远中柱赤霉素处理与未处理的酶活有极显著差异，这可能与远中柱较靠近果实外围受赤霉素影响较大有关。但是，粒化时期，POD同工酶谱实验中，却发现离子结合POD出现了5个特异性碱性POD组分，可能与汁胞粒化关系密切（待发表）。所以，POD在粒化过程中所扮演的具体角色仍有待进一步研究。

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