超表达OsPIN1a与野生型水稻旗叶水通道蛋白基因家族表达比较

李培纲 张付康 杨国 潘伟槐 金晨钟 莫亿伟

摘 要 为了探讨超表达OsPIN1a对水稻旗叶水通道蛋白基因家族表达影响，以转基因株系3和7-5及野生型水稻盛花期旗叶为材料，通过半定量PCR检测各基因表达水平，结果发现：（1）转基因和野生型都呈现OsTIPs家族表达量最大，OsPIPs家族次之，再次是OsNIPs和OsSIPs家族。（2）转基因和野生型都呈现OsPIP1-1、OsPIP2-7和OsPIP2-6的表达最高，OsPIP2-4，OsPIP2-2表达较低，而OsPIP1-2、OsPIP1-3、OsPIP2-1、OsPIP2-3和OsPIP2-8在旗叶内均不表达；转基因的OsPIP1-1，OsPIP2-4、OsPIP2-6和OsPIP2-7表达明显高于野生型。（3）转基因和野生型都呈现OsTIP1-1、OsTIP1-2、OsTIP2-2、OsTIP3-1、OsTIP4-2与OsTIP4-3表达较高，而OsTIP3-2、OsTIP5-1的表达相对较低；转基因株系3的OsTIP3-2和OsTIP5-1表达均高于野生型，但OsTIP3-1、OsTIP4-1和OsTIP4-3明显低于野生型；转基因7-5株系中，除OsTIP4-3基因表达低于野生型外，其余基因的表达量均高于野生型。（4）OsNIP1-1、OsNIP2-1与OsNIP2-2在转基因和野生型均能表达，但OsNIP1-2、OsNIP1-4、OsNIP3-2、OsNIP3-3和OsNIP4-1均不表达，但野生型的OsNIP2-1与OsNIP2-2表达量均高于转基因。（5）转基因和野生型的OsSIP1-1均不表达，但野生型OsSIP1-2与OsSIP2-1表达量均高于转基因。试验结果表明，盛花期当天旗叶中OsTIPs基因家族表达量最大，超表达OsPIN1a影响了多个水通道蛋白基因表达。

关键词 水稻；旗叶；水通道蛋白；水分胁迫； 开花期

中图分类号 S511 文献标识码 A

Abstract To clarified the effect of over-expression OsPIN1a on aquaporin genesexpression in rice， the flag leaves of two OsPIN1a transgenic lines（3， 7-5）and a wild-type line at flowering stage were used as material. Semi-quantitative RT-PCR was applied to detect the aquaporin genesexpression level. The results showed that： （1） The expression level of OsTIPs was highest in both transgenic lines and wild-type， followed by OsPIPs， and then is OsNIPs and OsSIPs. （2） OsPIP1-1、OsPIP2-7 and OsPIP2-6 showed the higher expression than OsPIP2-4，OsPIP2-2，while OsPIP1-2、OsPIP1-3、OsPIP2-1、OsPIP2-3 and OsPIP2-8 could not be detected in the flag leaves of two transgenic lines and wild-type. And the expression of OsPIP1-1， OsPIP2-4， OsPIP2-6 and OsPIP2-7 in transgenic lines were significantly higher than in wild-type. （3） All the strains had a high expression of OsTIP1-1、OsTIP1-2、OsTIP2-2、OsTIP3-1、OsTIP4-2 and OsTIP4-3 and a low expression of OsTIP3-2、OsTIP5-1. Comparing to the wild-type， the transgenic lines 3 had a higher expression in OsTIP3-2， OsTIP5-1 and a lower expression in OsTIP3-1， OsTIP4-1 and OsTIP4-3. Except for OsTIP4-3， all the genes in transgenic lines7-5 had higher expression than in wild-type. （4）OsNIP1-1， OsNIP2-1 and OsNIP2-2 could be detected， while OsNIP1-2， OsNIP1-4， OsNIP3-2， OsNIP3-3 and OsNIP4-1 could not be detected in all the strains. The expression of OsNIP2-1 and OsNIP2-2 was higher in the wild-type than in transgenic lines. （5）OsSIP1-1 showed no expression in both transgenic lines and wild-type strain. The expression of OsSIP1-2 and OsSIP2-1 was higher in wild-type than in transgenic line. In conclusion， OsTIPs had the highest expression in rice flag leaves on the day of the flowering stage， and over-expression of OsPIN1a could affect the expression of some aquaporin genes.

Key words Rice；Flag leaf；Aquaporin；Water stress；Flowering stage

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.012

水稻开花期对水分胁迫最为敏感，若此时发生水分胁迫对籽粒受精及充实均有很大影响，所以维持花期水分供应显得极为重要。植物体内水分运输主要通过不同类型的水通道蛋白完成，水稻水通道蛋白主要由质膜嵌入蛋白（plasma membrane intrinsicprotein，PIP）、液胞膜嵌入蛋白（tonoplast intrinsicprotein，TIP）、类Nod26膜嵌入蛋白（nudolin 26-like intrinsic protein，NIP）和膜嵌入小分子碱性蛋白（small basic intrinsic protein，SIP）33个基因组成的家族[1]，正是由于水通道蛋白家族存在，可以使水分子快速地通过跨膜运输，阻挡其他的小分子和离子的运输[2]。旗叶作为水稻最重要功能叶，其生理活性直接影响到籽粒的充实过程[3-4]。有研究发现，氮高效品种扬稻6号的旗叶与氮低效品种农垦57及日本晴相比，扬稻6号的旗叶不易衰老， 更利于籽粒灌浆和充实[5]。也有研究认为，水分供应水平对旗叶光合速率的影响程度要大于氮肥的影响[6]，说明水分供应对旗叶生理功能的维持是至关重要，若水稻开花期水分亏缺，则会显著降低稻米产量和品质[7]。项目组前期研究表明，水稻盛花期当天稻穗相对含水量最低，若在高温胁迫下，稻穗的相对含水量下降则更为明显，超表达生长素（IAA）极性运输输出载体OsPIN1a的转基因水稻耐高温能力明显优于野生型，可能是OsPIN1a超表达后加强了IAA的极性运输能力，提高对高温胁迫的抗性所致[8]。近年来，IAA参与植物对逆境胁迫的响应已受广泛的关注，有研究认为IAA合成及其应答关键基因受环境胁迫的调控，但在分子水平上深入研究逆境胁迫与生长素的调控响应机制还有待深入[9]；还有研究发现，局部IAA合成在抵抗高温和干旱等逆境胁迫中均有重要的作用[10]。项目组前期研究还发现，在气培缺水时，IAA能诱导水稻根毛着生密度和生长速率，增强根系在空气中对水分吸收能力，并能诱导部分水通道蛋白基因表达[11]，因此IAA在植物响应逆境调节过程中可能起到积极作用，而旗叶是水稻生长后期最重要功能叶，叶片内水分含量对其生理功能的维持有着重要意义，但旗叶水分供给与水通道蛋白基因家族基因表达是否受IAA极性运输的影响却鲜有报道，笔者通过探讨超表达OsPIN1a转基因和野生型水稻花期旗叶水通道蛋白基因家族的表达差异，为水稻花期水分供应提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试水稻（Oryza sativa L.）品种为粳稻中花11、转OsPIN1a水稻株系正常表达株系3和极高表达的株系7-5[12]。

1.2 方法

于2015年4月中旬在绍兴文理学院生物基地采用盆栽种植，盆钵（直径45 cm、高25 cm）内装过筛并充分拌匀的砂壤土10 kg，按常规水肥方式管理。在2015年7月底在水稻盛花期当天，取转基因和野生型水稻的旗叶，用RNA plant Regeant（TIANGEN，北京）植物总RNA提取试剂盒提取总RNA后，再合成cDNA，其中cDNA第一链合成使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNAase H）反转录酶（TIANGEN，北京），参照试剂盒说明书进行。采用半定量RT-PCR方法检测转基因与野生型水稻水通道蛋白基因家族表达，根据前人研究结果[1]，使用表1的RT-PCR引物，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系（25 μL）（TIANGEN，北京）：2×MasterMix12.5 μL、Primer F（10 μM）1.0 μL、Primer R（10 μmol/L）1.0 μL、cDNA第一链0.7～1.1 μL（根据β-actin扩增的电泳结果进行调整）、加dd H2O补足到25 μL，PCR仪为美国Bio-Rad公司（型号：BS97MyCycler）。

PCR反应条件是：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，59.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃下保温5 min；内参基因β-actin上游引物5′-CAGCACATTCCAGCAGATGT-3′，β-actin下游引物5′-TAGGCCGGTTGAAAACTTTG-3′，内参基因β-actin的PCR反应条件是： 94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，56.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃下保温10 min，PCR 扩增产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并对电泳结果比较。

2 结果与分析

2.1 转基因与野生型水稻旗叶OsPIPs基因家族表达的比较

由图1可知，质膜水通道蛋白OsPIPs基因家族中，转基因和野生型均呈现出OsPIP1-1和OsPIP2-7表达量最大，然后是OsPIP2-6，而OsPIP2-4和OsPIP2-2表达则相对较低。但OsPIP1-2、OsPIP1-3、OsPIP2-1、OsPIP2-3和OsPIP2-8在转基因及野生型中均不表达，可能这些基因在旗叶水分运输中作用不大。此外，转基因株系7-5的OsPIP1-1、OsPIP2-4和OsPIP2-7的表达量明显高于野生型，转基因株系3的OsPIP2-4，OsPIP2-6则明显高于野生型。说明超表达OsPIN1a后，提高旗叶部分OsPIP基因的表达，但在不同转基因株系间存在一定的差异，可能与OsPIN1a在不同株系间表达量不同有关。

2.2 转基因与野生型水稻旗叶水通道蛋白OsTIPs基因家族表达的比较

由图2可知，液泡膜水通道蛋白OsTIPs基因家族中，除OsTIP2-1基因不表达外，其余基因均能表达，转基因和野生型均呈现出OsTIP1-1、OsTIP1-2、OsTIP2-2、OsTIP3-1、OsTIP4-2与OsTIP4-3表达水平较高，而OsTIP3-2与OsTIP5-1的表达水平则相对较低。转基因株系3中OsTIP3-2和OsTIP5-1的表达水平明显高于野生型，但OsTIP3-1、OsTIP4-1和OsTIP4-3则明显低于野生型；在转基因7-5株系中，除了OsTIP4-3基因表达低于野生型外，其余基因的表达量均高于野生型。说明超表达OsPIN1a后影响部分OsTIPs的表达。

2.3 转基因与野生型水稻旗叶水通道蛋白OsNIPs基因家族表达的比较

由图3可知，OsNIPs基因家族中，OsNIP1-1、OsNIP2-1与OsNIP2-2在转基因和野生型中均能表达，而OsNIP3-1只在野生型株系和转基因株系3中表达，在7-5株系中则不表达。无论是转基因还是野生型水稻旗叶中的OsNIP1-2、OsNIP1-4、OsNIP3-2、OsNIP3-3和OsNIP4-1均不表达，说明这些基因在旗叶内可能对水分运输的作用不大。在野生型的OsNIP2-1与OsNIP2-2表达水平明显高于2个转基因株系，而OsNIP1-1与OsNIP3-1则明显低于转基因株系。其中在7-5株系中，整个OsNIPs基因家族的表达水平都低于野生型。

2.4 转基因与野生型水稻旗叶水通道蛋白OsSIPs基因家族表达的比较

由图4可知，在OsSIPs基因家族中，OsSIP1-1在转基因和野生型中均不表达。其中OsSIP1-2的表达水平很低，而野生型的OsSIP2-1的表达水平明显高于2个转基因株系，说明超表达OsPIN1a后降低OsSIPs的表达。

3 讨论与结论

3.1 不同水通道蛋白基因家族在旗叶内的表达模式不同

植物液泡在调节细胞膨压、渗透作用、储存物质等方面都有重要作用[13]。如液泡中的TIPs与PIPs都可以调控水分跨膜运输[14]。本研究结果表明，转基因和野生型水稻，盛花期的旗叶内4类水通道蛋白基因家族之间表达有明显的差异性，表达量最大是OsTIPs基因家族，说明旗叶液泡膜水通道蛋白在旗叶的水分转运中可能起着最重要的作用。因为有研究结果发现，水稻的OsTIP1-1在油菜中超表达后，能显著提高转基因油菜根系水分运输效率，增强其耐旱能力[15]。本研究结果也发现，除OsTIP1-1高表达以外，其他8个OsTIPs的表达量也很高；其次是质膜水通道蛋白OsPIPs基因家族，有研究结果表明质膜有OsPIPs是细胞水分运输的关键蛋白，参与多种重要物质的运输与交换，在植物发育的各个阶段均发挥重要作用[16]；而且OsPIP2-6还受ABA处理及淹水、盐胁、干旱等逆境胁迫后表达量明显提高，可能更利于水分的快速运输，减轻逆境胁迫导致的水分胁迫[17]。OsNIPs和OsSIPs基因家族表达水平比较低，说明2种基因家族在旗叶水分转运过程的作用可能较小，本研究结果与前人发现不同的水通道蛋白基因在不同组织表达存在的差异性一致[18-19]。因此，在水稻盛花期的旗叶内，不同类型水通道蛋白的差异表达可能与对水分运输的功能分工有关，具体原因还需深入研究。

3.2 超表达OsPIN1a影响旗叶部分水通道蛋白基因表达

本研究结果表明，超表达OsPIN1a后旗叶中OsPIP2-4、OsPIP2-6、OsTIP1-2、OsTIP3-2、OsTIP5-1、OsNIP1-1和OsNIP3-1的表达量明显高于野生型，这些基因表达上调可能更有利于水分运输，因为前人研究结果发现，在拟南芥内超表达PgTIP1后，改变了水分透过液泡膜的速率达到提高耐旱、耐盐和耐低温胁迫能力[20]。项目组的前期研究结果也表明，在高温胁迫下转OsPIN1a水稻稻穗的相对含水量高于野生型，可能是超表达后OsPIN1a对加强了水分的运输能力所致[8]。如当IAA合成增加后，不但能促进根系和根毛的数量增多，还能显著提高水分吸收和耐旱性[21-22]，如适度干旱则启动水稻根尖ABA的快速积累，再促进IAA合成和运输效率，不但增强根尖细胞的可塑性，还能保证逆境下根系获得更多水分[23]。所以转OsPIN1a基因水稻在增加IAA运输效率后，可能通过一定的方式调控不同的水通道蛋白基因表达，增强水分运输能力，相应地提高抗逆能力[24]，如超表达OsTIP1-1的转基因油菜，耐旱能力明显高于野生型[15]。本研究结果也发现，超表达OsPIN1a转基因水稻的OsTIP3-1、OsTIP4-1和OsTIP4-3、OsNIP2-1、OsNIP2-2、OsSIP1-2和 OsSIP2-1基因表达都低于野生型，可能是不同的水通道蛋白基因的功能差异所致，也许降低这些基因表达后，能抑制旗叶细胞内水分外排，达到提高旗叶的水分含量。如在淹水条件下OsPIP2-6还能起到将过多水分外排的作用，以维持植株水分的平衡[17]。因此，水通道蛋白一方面能促进水分进入细胞，以利于水分在细胞间的运输[25]，如在干旱胁迫初期，通过提高PIP1表达量，增加对水分吸收能力，但随着加剧，PIP1表达量明显下降，达到减少细胞水分外排作用，因此水通道蛋白功能的双重性在提高植物抗逆性方面有着积极作用[26-28]，超表达OsPIN1a后，IAA具体通过何种途径影响旗叶内不同的水通道蛋白基因差异表达还需深入研究。

本研究表明水稻盛花期当天，转基因和野生型水稻旗叶的OsTIPs基因家族表达最高，然后是OsPIPs和OsNIPs基因家族，最低是OsSIPs基因家族，说明液泡膜水通道蛋白在旗叶水分供应能起着最重要作用；超表达OsPIN1a的转基因水稻提高IAA极性运输速率后，促进多个水通道蛋白基因表达；但相同类型水通道蛋白基因间的差异表达，可能与其分工不同有关。

参考文献

[1] Sakurai J， Ishikawa F， Yamaguchi T， et al. Identification of 33 rice Aquaporin genes and analysis of their expression and function[J]. Plant Cell and Physiology， 2005， 46（9）： 1 568-1 577.

[2] 朱美君， 康 蕴， 陈 珈， 等. 植物水通道蛋白及其活性调节[J]. 植物学报， 1999， 16（1）： 44-50.

[3] 蔡瑞国， 张 敏， 尹燕枰， 等. 小麦灌浆过程中旗叶光合及抗氧化代谢与氮素营养关系研究[J]. 中国农业科学， 2008， 41（1）： 53-62.

[4] 史正军， 樊小林. 干旱胁迫对不同基因型水稻光合特性的影响[J]. 干旱地区农业研究， 2003， 21（3）： 123-126.

[5] 王碧茜， 范晓荣， 徐国华， 等. 不同氮效率水稻品种旗叶的衰老特征[J]. 南京农业大学学报， 2010， 33（2）：8-12.

[6] 徐 璇， 周 瑞， 谷艳芳， 等. 不同水氮耦合对小麦旗叶主要光合特性的影响[J]. 河南大学学报（自然科学版）， 2010， 40（1）： 53-57.

[7] 刘 凯， 张 耗， 张慎凤，等. 结实期土壤水分和灌溉方式对水稻产量与品质的影响及其生理原因[J]. 作物学报， 2008， 34（2）： 268-276.

[8] 冯芳玖， 李静婷， 郭丹凤， 等. 年份气温差异对野生型和转OsPIN1a基因水稻胚乳发育及种子萌发的影响[J]. 核农学报， 2015， 29（11）： 2 198-2 207.

[9] 李 静， 崔继哲， 弭晓菊. 生长素与植物逆境胁迫关系的研究进展[J]. 生物技术通报， 2012（6）： 13-17.

[10] 翟开恩， 潘伟槐， 叶晓帆， 等. 高等植物局部生长素合成的生物学功能及其调控机制[J]. 植物学报， 2015， 50（2）： 149-158.

[11] 莫亿伟， 李夏杰， 王 海， 等. IAA 对水稻根毛形成与水通道蛋白基因表达关系的研究[J]. 中国农业科学， 2015， 48（21）： 422（2）： 83-89.

[13] Wink M. The plant vacuole： a multifunctional compartment[J]. Journal of Experimental Botany， 1993， 44（258）： 231-246.

[14] Maurel C， Tacnet F， Guclu J， et al. Purified vesicles of tobacco cell vacuolar and plasma membranes exhibit dramatically different water permeability and water channel activity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1997， 94（13）： 7 103-7 108.

[15] 张 帆， 李玉萍， 孙卫宁， 等. 液泡膜内在蛋白基因OsTIP1； 1异位表达对油菜根皮层细胞水分关系参数的影响[J]. 植物生理学报， 2014， 50（12）： 1 863-1 870.

[16] 魏毅东， 张 扬， 许惠滨， 等. 水稻OsPIP1； 2植物过表达及亚细胞定位载体的构建[J]. 分子植物育种， 2013， 11（4）： 485-493.

[17] 李 嵘， 牛向丽， 苗雁文， 等. 水通道蛋白基因OsPIP2； 6的功能分析[J]. 中国农业科学， 2013， 46（15）： 3 079-3 086.

[18] Wudick M M， Luu D T， Maurel C. A look inside：Localization patterns and functions of intracellular plant aquaporins[J]. New Phytologist， 2009， 184（2）： 289-302.

[19] 林燕飞， 李红梅， 丁岳练，等. 2013. 唐菖蒲质膜水孔蛋白基因GhPIP1； 1的克隆及表达分析[J]. 园艺学报， 40（1）： 145-154.

[20] Peng Y， Lin W， Cai W， et al. Overexpression of a Panax ginseng tonoplast aquaporin alters salt tolerance， drought tolerance and cold acclimation ability in transgenic Arabidopsis plants[J]. Planta， 2007， 226（3）： 729-740.

[21] Park H C， Cha J Y， Yun D J. Roles of YUCCAs in auxin biosynthesis and drought stress responses in plants[J]. Plant Signaling and Behavior， 2013， 8（6）： e24495-1-e24495-3.

[22] Kim J I， Baek D， Park H C， et al. Overexpression of Arabidopsis YUCCA6 in potato results in high-Auxin developmental phenotypes and enhanced resistance towater deficit[J]. Molecular Plant， 2013， 6（2）： 337- 349.

[23] Xu W， Jia L， Shi W， et al. Abscisic acid accumulation modulates auxin transport in the root tip to enhance proton secretion for maintaining root growth under moderate water stress[J]. New Phytologist， 2013， 197（1）： 139-150.

[24] Jarzyniak K M， Jasinski M. Membrane transporters and drought resistance-a complex issue[J]. Frontiers in Plant Science，2014， 5（12）： 1-15.

[25] 侯晓婉， 胡 伟， 颜 彦，等. 香蕉MaPIP2-2基因的克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 热带作物学报， 2015， 36（7）： 1 267-1 273.

[26] 徐 娜， 辛士超， 强晓晶， 等. 番茄SlMIP基因参与转基因拟南芥的渗透调节[J]. 植物营养与肥料学报， 2014， 20（1）： 195-204 .

[27] 孙琳琳， 辛士超， 强晓晶，等. 非生物胁迫下植物水通道蛋白的应答与调控[J]. 植物营养与肥料学报， 2015， 21（4）： 1 040-1 048.

[28] Liu C， Fukumoto T， Matsumoto T， et al. Aquaporin OsPIP1； 1 promotes rice salt resistance and seed germination[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 63（4）： 151-158.