落叶松-杨栅锈菌MKK基因的克隆与生物信息学分析1)

李瑞茜　于丹　余仲东　曹支敏

(西北农林科技大学，杨凌，712100)



落叶松-杨栅锈菌MKK基因的克隆与生物信息学分析1)

李瑞茜于丹余仲东曹支敏

(西北农林科技大学，杨凌，712100)

摘要利用同源克隆技术，从落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)菌株Wh03中克隆得到酿酒酵母MKK1和MKK2的同源基因，命名为MlpMKK1/2-WH。测序结果显示，MlpMKK1/2-WH基因的开放阅读框长度为1 218 bp，编码405个氨基酸。MlpMKK1/2-WH蛋白具有保守的PKc_Pek1_like和Pkinase结构域。系统进化树分析表明,MlpMKK1/2-WH与柄锈菌属3种锈菌中的同源蛋白亲缘关系最近。

关键词落叶松-杨栅锈菌；MKK基因；同源克隆；生物信息

分类号S718.81；S763.11

Cloning and Bioinformatical Analysis of MKK Gene fromMelampsoralarici-populina//

Li Ruixi, Yu Dan, Yu Zhongdong, Cao Zhimin

(Northwest A & F University, Yangling 712100, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：84-87.

By using homology-based cloning method, the geneMlpMKK1/2-WH was cloned and sequenced fromMelampsoralarici-populina(Mlp) Chinese strain Wh03. The full-length ORF ofMlpMKK1/2-WH was 1 218 bp, encoding 405 amino acid residues. The deducedMlpMKK1/2-WH protein contains conserved PKc_Pek1_like and Pkinase domains. By phylogenetic analysis, MlpMKK1/2-WH had the closest relationship with the othologs from three rust fungi belonging to the genusPuccinia.

KeywordsMelampsora larici-populina； MKK gene； Homology cloning； Bioinformatical analysis

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)级联反应途径在适应环境胁迫和形态调节方面具有重要的作用[1]。在信号转导方面具有关键作用的MAPK级联反应途径在真核生物中普遍存在，一般包括依次被磷酸化而激活的3个相互关联的蛋白激酶[2-3]，分别为丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK或MEKK)、丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK或MEK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。模式物种酿酒酵母中MAPK信号途径研究的较为深入和全面，主要包含Kss1/Fus3类、Kss1类、Slt2类、Hog1类和Smk1类5种MAPK途径[4]。其中，Bck1-MKK1/MKK2-Slt2类MAPK途径调控酿酒酵母细胞壁完整性并促进其细胞壁的生物合成[5]。在酿酒酵母中，任何一个MKK基因的缺失都没有产生明显的表型缺陷，而MKK1和MKK2基因同时缺失却引起一种对温度敏感但可被渗透压稳定剂抑制的细胞裂解缺陷[6]。研究表明，玉米黑粉病菌MKK1基因比较保守，参与了该物种细胞壁完整性的调控[7]。人类病原新型隐球菌MKK1基因是温度敏感型相关基因，也在维持细胞壁完整性方面具有重要作用，同时该基因的缺失会导致病原菌黑色素产量的下降[8]。落叶松-杨栅锈菌是一种转主寄生真菌，在世界范围内引起杨树叶锈病，严重危害杨树生产，从而造成重大经济损失[9-10]。本研究根据落叶松-杨栅锈菌标准菌株中预测的MKK1和MKK2同源基因MKK1/2，同源克隆菌株Wh03中MKK1/2基因，并对其进行生物信息学分析，为进一步明确目的基因在落叶松-杨栅锈菌生长发育和致病过程中的作用提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

试验用Wh03(陕西渭河)为我国落叶松-杨栅锈菌单孢菌株，由西北农林科技大学林学院森林病理学实验室提供。用太白杨(Populuspurdomii)作为繁殖寄主在温室人工扩繁，参照曹支敏等的方法[11]进行菌种活化及保存。

引物由上海生工合成，总RNA提取试剂盒来自QIAGEN公司，反转录试剂盒和Taq酶来自Thermo公司，TransStartFastPfu酶来自全式金公司，pMD19-T(simple)载体来自TAKARA公司，胶回收试剂盒来自Bioflux公司，测序由北京奥科公司完成。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成

落叶松-杨栅锈菌夏孢子总RNA提取参考QIAGEN公司Rneasy Plant Mini Kit试剂盒说明书进行，分别用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000检测RNA样品的质量和浓度。参考Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录。

1.2.2目的基因片段的克隆及测序

根据落叶松-杨栅锈菌标准菌株98AG31全基因组数据库(http://genome.jgi.doe.gov/Mellp1/Mellp1.home.html)中Protein ID 38429基因序列，用Primer Premier 5软件设计引物，从该锈菌中国菌株Wh03夏孢子cDNA中PCR扩增目的基因。

上游引物，MKK-F(5′ATGAATGGGATCGGAGGAAG3′)；下游引物，MKK-R(5′CTAAGAAGTAGTAGTAGTAGTAGA 3′)。用TransStartFastPfu酶进行PCR扩增，反应体系，5×TransStartFastPfuBuffer 10 μL、2.5 mmol·L-1dNTP 5 μL、引物各1 μL、模板(稀释5倍)1.5 μL、TransStartFastPfu酶1 μL、加水补齐至50 μL。PCR扩增条件，95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸38 s，35个循环；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。在PCR产物中加入0.6 μLTaq酶，72 ℃延伸30 min。

PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Bioflux)回收目的条带。将回收产物连接至pMD19-T(simple)载体，利用电击法转化将重组子转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，将鉴定结果为阳性的转化子送至北京奥科公司测序。

1.2.3编码蛋白生物信息学

利用Bioedit软件推导氨基酸序列；利用ExPASy网站在线工具ProtParam分析氨基酸的相对分子质量、残基数目与组成、等电点和稳定性等信息；利用NCBI网站Conserved domains数据库分析蛋白的保守结构域；基因编码的蛋白二级结构由SOPMA在线工具进行预测；利用Clustalx软件对同源序列进行多序列比对，MEGA6分子进化遗传分析软件通过邻位相连法构建系统进化树，系统树每个统计学显著性分析以自展法进行检验，重复1 000次[12]。

2结果与分析

2.1目的基因克隆

利用酿酒酵母MKK1和MKK2的蛋白序列为诱饵，在落叶松-杨栅锈菌标准菌株98AG31和酿酒酵母标准菌株S288c全基因组数据库中比对分析，得到落叶松-杨栅锈菌标准菌株98AG31中的同源基因MKK1/2(Protein ID 38429)。提取落叶松-杨栅锈菌中国菌株Wh03夏孢子总RNA，反转录为cDNA，以此cDNA为模板，根据38429基因序列设计特异引物，从中国菌株夏孢子cDNA中进行同源克隆。

通过PCR扩增，得到1条与预测结果较为一致的大约1 250 bp的条带(图1)。切胶回收目的条带，TA克隆测序并进行比对分析。结果显示，该cDNA片段具有完整开放阅读框(ORF)，长度为1 218 bp，编码405个氨基酸。因此，将落叶松-杨栅锈菌中国菌株中克隆获得的该基因命名为MlpMKK1/2-WH。

M1.1kb ladder；M2.DS 2000；MKK1/2.落叶松-杨栅锈菌中国菌株MKK1/2基因PCR扩增产物。

图1落叶松-杨栅锈菌中国菌株MKK1/2基因PCR扩增

2.2目的基因预测蛋白结构

MlpMKK1/2-WH基因ORF序列及其推导的蛋白序列如图2所示。预测的MlpMKK1/2-WH蛋白相对分子质量为44 810，亲水性平均系数(GRAVY)为-0.426，说明它为亲水性蛋白。预测蛋白负电荷残基(Asp+Glu)总数为50个，正电荷残基(Arg+Lys)总数41个。理论等电点为5.66，即偏酸性。预测蛋白不稳定指数为41.53，超过40，推测MlpMKK1/2-WH蛋白属于不稳定蛋白。利用NCBI CDD数据库分析MlpMKK1/2-WH蛋白的结构域，结果显示该蛋白具有与酿酒酵母MKK1及MKK2蛋白一致的2个保守结构域，分别为PKc_Pek1_like和Pkinase(图3)。蛋白质的二级结构是蛋白质分子中重要的部件，用SOPMA软件对MlpMKK1/2-WH蛋白二级结构进行预测，结果显示，其包含33.09%的α-螺旋，9.88%的β-转角，40.99%的无规则卷曲，16.05%的延伸链(图4)。据此推测，α-螺旋和无规则卷曲构成了MlpMKK1/2-WH蛋白的主要二级结构，无规则卷曲散布于整个蛋白中。

2.3目的基因进化关系

利用NCBI蛋白数据库和BROAD蛋白数据库进行比对检索，将克隆得到的落叶松-杨栅锈菌MlpMKK1/2-WH蛋白序列与酿酒酵母、白色念珠菌、稻瘟菌、小麦赤霉菌、灰霉菌、双色蜡蘑、玉米黑粉菌、小麦条锈菌、小麦秆锈菌、小麦叶锈菌等模式物种MKK1和MKK2同源基因的蛋白序列一起构建系统进化树(图5)。结果显示，子囊菌中的MKK1和MKK2聚为一类，担子菌中的MKK1和MKK2归为另一大类。MlpMKK1/2-WH与柄锈菌属3种锈菌中的同源蛋白亲缘关系最近，这与分类学中上述真菌同属于锈菌目相一致。

图2　MlpMKK1/2-WH基因ORF核苷酸序列及其推导的氨基酸序列(“*”代表终止子)

图3　MlpMKK1/2-WH基因氨基酸序列保守结构域

图4　MlpMKK1/2-WH基因编码蛋白二级结构组成

图5　落叶松-杨栅锈菌MlpMKK1/2-WH系统进化树

3结论与讨论

Bck1-MKK1/MKK2-Slt2信号通路在真菌中具有高度保守性。其中，起到承上启下作用的丝裂原活化蛋白激酶激酶MKK1/MKK2参与了真菌细胞壁完整性和致病性等方面的调控过程，尤其在维持细胞壁完整性方面具有重要作用[6-8]。由专性寄生的落叶松-杨栅锈菌侵染引起的杨树叶锈病是一种严重危害杨树生产的世界性重大真菌病害。目前，该锈菌MKK1/MKK2基因的功能尚不清楚。笔者首次克隆到落叶松-杨栅锈菌中国菌株MKK1/MKK2同源基因，命名为MlpMKK1/2-WH，该基因开放阅读框长度为1 218 bp，生物信息学分析显示该蛋白具有保守的结构域，亲缘关系与柄锈菌属3种锈菌最近，从而为阐明目的基因在该锈菌生长发育和致病过程中的作用奠定一定的理论基础。

以酿酒酵母MKK1和MKK2蛋白序列为诱饵进行比对分析，结果显示，MKK1和MKK2在落叶松-杨栅锈菌标准菌株98AG31中的同源基因相同(Protein ID 38429)。因此，将该基因命名为MlpMKK1/2。根据落叶松-杨栅锈菌标准菌株98AG31中MlpMKK1/2的基因序列，同源克隆得到该锈菌中国菌株Wh03中的同源基因，因此，命名为MlpMKK1/2-WH。

供试中国菌株MlpMKK1/2-WH基因和标准菌株98AG31中的同源基因MlpMKK1/2(Protein ID 38429)的核苷酸序列的同源性达到99%，在7个位点上存在碱基的差异，并且前者碱基数量较后者多3个。氨基酸水平上，二者的同源性也达到99%，由于碱基数量的增加，前者比后者多1个苏氨酸。这说明在来自中国和欧洲的2个Mlp菌株中，该基因氨基酸序列变异较小，较为保守。

系统进化树结果显示，在进化过程中酿酒酵母和白色念珠菌物种内部发生复制；而所列的另外3种丝状子囊菌及担子菌中未发生复制，因此含有1个同源基因MKK1/2。

MlpMKK1/2-WH基因的成功克隆是研究其功能的基础。保守结构域分析显示该基因具有与酿酒酵母MKK1及MKK2蛋白一致的2个保守结构域。因此，该基因在落叶松-杨栅锈菌细胞壁完整性调控和致病过程方面是否具有保守的功能，还有待于进一步的研究。

参考文献

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[12]KUMAR S, TAMURA K, NEI M. MEGA: Molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers[J]. CABIOS,1994,10(2):189-191.

收稿日期：2015年11月1日。

第一作者简介：李瑞茜，女，1990年3月生，西北农林科技大学林学院，硕士研究生。E-mail：lrx327@outlook.com。通信作者：曹支敏，西北农林科技大学林学院，教授。E-mail：zmcao@nwsuaf.edu.cn。

1)国家自然科学基金项目(31300544)；西北农林科技大学基本科研业务费(QN2013014；2452015332)。

责任编辑：程红。