石楠锈孢锈菌重寄生现象及其重寄生菌的种类鉴定1)

李梦婕　谢津　李向楠　陈玉惠

(西南林业大学，昆明，650224)



石楠锈孢锈菌重寄生现象及其重寄生菌的种类鉴定1)

李梦婕谢津李向楠陈玉惠

(西南林业大学，昆明，650224)

摘要研究了昆明地区石楠锈孢锈菌(Aecidium pourthiaea)上的重寄生现象并对重寄生菌进行了分离、回接验证和鉴定。结果显示：石楠锈孢锈上的重寄生菌在7月底逐渐发生，其自然重寄生率从10月中旬开始快速增长，12月中旬达到高峰。石楠锈孢锈的重寄生菌包括链格孢属(Alternaria spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)、枝孢属(Cladosporium spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、木霉属(Trichoderma sp.)的真菌及粉红单端孢(Trichothecium roseum)等多种，其中重寄生效果及对锈菌寄主植物安全性最好的菌株为拟盘多毛孢属的SYP22菌株和枝孢属的SYC23菌株。

关键词石楠锈孢锈菌；重寄生菌；人工培养

分类号S763.11;Q939.95

Hyperparasitism onAecidiumpourthiaeaand Species Identification of the Mycoparasite//

Li Mengjie, Xie Jin, Li Xiangnan, Chen Yuhui

(Southwest Forestry University, Kunming 650224, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：92-96.

We observed the hyperparasitism of mycoparasite onAecidiumpourthiaeain Kunming, and isolated and identified the mycoparasite. The mycoparasites onAecidiumpourthiaeaappeared on the aecium ofAecidiumpourthiaeasince the end of July, were rapidly increased from the middle of October, and reached a peak in the middle of December. The various mycoparasite onAecidiumpourthiaeamainly includedAlternariaspp.,Pestalotiopsisspp.,Cladosporiumspp.,Fusariumspp.,Trichodermasp., andTrichotheciumroseum, and SYP22 (a strain ofPestalotiopsis) and SYC23 (a strain ofCladosporium) had better hyperparasitism effect and better safety to plant compared to other mycoparasites.

KeywordsAecidium pourthiaea； Mycoparasite； Artificial rearing

石楠锈孢锈菌(Aecidiumpourthiaea)是石楠(Photiniaprionophylla)锈病的病原菌，主要危害3年生以下幼树及幼苗，引起叶、腋芽和梢坏死，严重影响石楠的正常生长及观赏价值[1]。重寄生菌在植物病害生物防治中是非常重要的菌种资源，已经越来越受到各国植物病理学家的重视。笔者在进行锈菌重寄生菌调查时发现，在石楠锈孢锈的锈子器上有明显的多种重寄生现象，且对石楠锈孢锈的锈子器和锈孢子具有显著的破坏作用。关于锈菌的重寄生现象及重寄生菌已有较多报道，目前已发现的能够被重寄生的锈菌有茶藨生柱锈(Cronartiumribicola)[2-3]、梨胶锈菌(Gymnosporangiumasiaticum)[4]、落叶松拟三胞锈菌(Triphragmiopsislaricinum)[5-6]、杨柴锈病菌(Uromyceshedysari-mongolici)[7]、黄柏鞘锈菌(Coleosporiumphellodendri)[8]和松芍柱锈菌(Cronartiumflaccidum)[9]等，但至今未见对石楠锈孢锈菌重寄生菌的报道。本研究对重寄生菌在石楠锈孢锈菌的寄生现象及其发生特点进行了研究，并对重寄生菌进行了分离及种类鉴定，以期为石楠锈病的生物防治提供理论参考和菌种资源。

1材料与方法

1.1重寄生菌的寄生情况调查

于2014年7—12月，每隔15 d在西南林业大学一样地内随机抽取已有石楠锈孢锈菌锈子器的石楠病叶100片，观察记录重寄生菌寄生锈菌的现象。重寄生率=(被寄生叶片数/总叶片数)×100%。

1.2材料采集

于2013年和2014年的9月上旬至11月下旬，在西南林业大学石楠种植区设置3个样点，分6次在各样点随机选取5株感病石楠采集叶片，每株取样数不低于5份。取样时选取肉眼可见有重寄生现象发生的叶片，整片采下装入干净的塑料袋内带回实验室备用。

1.3菌株分离、纯化及鉴定

采用2种方法从被重寄生菌寄生的石楠病叶部位分离重寄生菌。方法一：以PDA为培养基，采用组织分离法进行分离[10]。方法二：将供试材料置于室温下保湿，待锈子器表面长出菌丝体后，用灭菌的接种针挑取少量菌丝体接种至PDA平板，(25±2)℃培养，待平板上长出菌落后做进一步纯化。待全部菌株纯化后，观察记录各菌株的培养性状；菌落产孢后，于显微镜下观察、记录各菌株的产孢特征、孢子形态及大小，查阅相关文献确定其分类地位，并将其归类到属。

1.4重寄生菌的回接验证

供试菌株和病叶：从已分离纯化的菌株中挑取20个菌株作为供试菌株。菌株号分别为：SYA03、SYA34、SYA65、SYP01、SYP03、SYP08、SYP16、SYP22、SYP27、SYC02、SYC06、SYC17、SYC23、SYC24、SYC45、SYF02、SYF05、SYT01、SYTr12和SYW21。供试病叶为已产明显锈子器和锈孢子但未被重寄生菌寄生的石楠病叶。

重寄生菌的确定：参照杨艳红的方法[2]。将放有滤纸的培养皿高温灭菌，在无菌条件下滴入少量无菌水浸润滤纸，然后将用75%乙醇表面消毒后的供试叶片着生锈子器面向上置于滤纸上，再将直径约5 mm的供试菌株菌块接种至锈子器上，每处理设3组重复。以不接供试菌的石楠病叶为对照1，以直接将菌块置于湿润滤纸上培养为对照2，(25±2)℃培养，3 d后观察并记录结果。

供试菌株对接种锈孢子的影响：挑取少量接种后的锈子器制成水片，于显微镜下观察其内锈孢子的变化情况。采用台盼蓝染色检测锈孢子活力，根据锈孢子着色情况计算锈孢子的死亡率。设锈孢子完好且孢子内含物未被染成蓝色为有活力者，反之则为死亡孢子。锈孢子死亡率=(死亡锈孢子数/视野内锈孢子总数)×100%。

重寄生菌的再分离：挑取“重寄生菌的确定”中各处理锈子器上生长的菌丝置于PDA平板上，(25±2)℃培养，待长出菌落后做进一步纯化，并与原供试菌株进行比较，鉴定其是否与原接种菌株一致。每菌株设4个重复。

2结果与分析

2.1重寄生菌的寄生现象及自然寄生率

野外观察发现，重寄生菌在石楠锈孢锈菌上的寄生较为相似，在寄生初期，可见在石楠锈孢锈菌的锈子器和散落出来的金黄色的锈孢子堆上出现点状菌落，随后菌落逐渐扩大覆盖整个锈子器及锈孢子堆(图1B)。随时间的推移，锈子器逐渐干瘪萎缩坏死。镜检发现，重寄生菌寄生后的锈子器内有重寄生菌的菌丝体生长，而锈子器内的锈孢子变形，颜色由黄色变为无色且内含物浓缩或溢出或整个孢子遭到破坏(图1C)。重寄生菌对锈菌寄主石楠叶的伤害差异很大，主要有3种表现：①重寄生菌寄生锈子器后，后期锈子器周围有限组织干枯坏死成灰白色枯斑并逐渐穿孔脱落(图1D)；②重寄生菌寄生后对石楠叶的伤害仅局限在锈子器生长部位，不会引起周围组织的褐变坏死，但寄生部位的叶组织变形凸起且呈黑色(图1E)；③重寄生菌寄生后除引起锈菌生长部位褐变外，还会不断引起周围组织的褐变坏死，尤其在寄生的中后期，叶片的大部分或整个叶都会褐变坏死(图1F)。

A.正常锈子器及锈孢子；B.重寄生菌在锈子器上形成的菌落(a)；C.锈子器内的重寄生菌菌丝体(b)及变色死亡的锈孢子(c)；D.干瘪萎缩的锈子器(d)及其周围的灰白色枯斑；E.凸起呈黑色的锈子器及周围未受影响的叶；F.褐变坏死的锈子器及大面积褐变的叶。

图1石楠锈孢锈菌的自然重寄生现象

石楠锈孢锈菌重寄生菌在野外于7月底逐渐发生，8—10月份其重寄生率呈缓慢的上升趋势，至10月底其重寄生率不足20%。在11—12月份，重寄生菌的寄生率快速增长，并于12月中旬达到增长高峰，重寄生率超过了50%，最高达到59%(表1)。重寄生率的不断上升与重寄生菌分生孢子的不断产生、传播和对寄主菌的反复侵染密切相关。

表1　石楠锈孢锈菌重寄生菌的重寄生情况

2.2菌种分离及鉴定

从供试材料上分离获得的菌株及鉴定结果见表2。表2显示，从3个样点采集的材料，采用2种分离方法分离6批，共获得真菌425株。其中已鉴定到属的有347株，分属于5个属，鉴定到种的有1种28株，不产孢尚不能判断其归属的有50株。虽然采样点不同，分离方法有异，但各样点采集的材料分离的结果呈现出较大的相似性，链格孢(Alternaria)、枝孢(Cladosporium)和拟盘多毛孢(Pestalotiopsis)3个属的真菌出现的频率均较高。

2.3重寄生菌接种

20个供试菌株接种于石楠感病叶上的石楠锈孢锈锈子器后，除未知菌株SYW21外，其余6个属的真菌菌株都能在石楠锈孢锈锈子器上定植生长，但不同菌株的生长状况和对石楠叶的影响差异较大。19个菌株中(表3)，枝孢SYC24菌株在锈子器上的生长最好，镰刀菌SYF02和SYF05、粉红单端孢SYTr12、枝孢SYC02和拟盘多毛孢SYP08菌株的生长则相对较差，而其余菌株在锈子器上的生长良好，接种3d后菌丝已基本覆盖整个锈子器。19株菌中除拟盘多毛孢SYP22和枝孢SYC02、SYC23外，其余菌株对石楠叶均有一定的伤害，其中链格孢属的所有菌株和拟盘多毛孢SYP03对叶片的伤害程度最大，菌株接种3 d后随着菌丝的生长蔓延，锈子器周围叶组织便开始逐渐褐变直至局部或整叶坏死。因此，19个供试菌株中能在石楠锈孢锈锈子器上旺盛生长且对石楠不造成伤害的重寄生菌为枝孢SYC23和拟盘多毛孢SYP22菌株。将以上各属真菌菌块直接置于保湿滤纸上培养，菌丝不生长或生长很差，只能形成稀疏的菌落，远不及在锈子器上的生长情况，且随着时间的延长，置于滤纸片上的菌块及其所形成的菌落逐渐枯萎、干瘪，不再生长。上述结果表明，这些真菌均有赖于锈孢锈锈子器内的锈孢子提供营养进行生长。

表2　各样点分离得到的真菌菌株及鉴定结果

表3　接种后各菌株菌丝生长状况及其对石楠叶和锈孢子活力的影响

注：表中接种和对照1中，“-”为菌丝未生长或叶片未见损伤；“+”为菌丝在锈子器上少量生长或着生锈子器部位叶出现褐斑；“++”为菌丝在锈子器上生长良好但尚未完全覆盖遮蔽锈子器或锈子器着生部位及周围有限范围内的叶组织出现褐变；“+++”为菌丝在锈子器上旺盛生长几乎完全覆盖遮蔽锈子器或锈子器着生部位及周围叶组织大部分出现褐变；“++++”表示菌丝生长旺盛且已完全覆盖遮蔽锈子器或接种叶几乎整叶褐变坏死。对照2中，“-”为菌块无明显变化，仅在菌块上长出少量菌丝，菌丝向外不延伸；“+”为菌块上菌丝向周围延伸形成小的稀疏菌落。“√”为出现此现象，“○”为无此现象。

对接种重寄生菌3 d后的锈孢子进行显微观察，发现重寄生菌不仅能使锈孢子明显褪色、变形，还能对锈孢子的外部结构或内部结构造成一定破坏而导致孢子死亡。供试菌株中的枝孢SYC17、SYC23、SYC24菌株和木霉SYT01菌株接种后的锈孢子可见锈孢子壁破裂，内含物浓缩、外溢，孢子死亡，其中尤以枝孢SYC24(图2B)和木霉SYT01最为显著，孢子死亡率均达到100%。而其他重寄生菌接种后的锈孢子外壁几乎未受到明显破坏，但内含物均不同程度发生浓缩且能被台盼蓝染色，表明锈孢子活力减弱甚至死亡。其中以拟盘多毛孢SYP03(图2C)、枝孢SYC06及3株链格孢接种后的锈孢子内含物浓缩现象最为明显，孢子死亡率最高，均达到100%。

A.对照锈孢子(正常锈孢子)；B.接种SYC24后的锈孢子(壁破裂，内含物浓缩)；C.接种SYP03后的锈孢子(孢子褪色、内含物浓缩)。

2.4重寄生菌再分离

重寄生菌再分离结果显示(表4)，从链格孢、镰刀菌、枝孢、拟盘多毛孢、木霉及粉红单端孢6个属的19个供试菌株接种后的锈子器上进行菌株再分离，均能得到与原菌株相同的真菌，说明锈子器及锈孢子的死亡均是以上菌株的作用所致，所以供试19个菌株均为石楠锈孢锈菌的重寄生菌。未知菌株SYW21在锈子器上不能生长，因此未对其进行再分离。

表4　供试菌株的再分离结果

注：“√”表明再分离所得菌株与原菌株(对照2)一致。

3讨论

目前已发现的锈菌重寄生菌有锈生座孢属(Tuberculina)[3-4,8]、锈寄生孢(Darlucafilum)[11]、镰刀菌属[12]、枝顶孢属(Acremonium)[13]、枝孢属[14]和木霉属[2,9]等多个属的真菌。本研究对石楠锈孢锈菌重寄生菌进行研究，发现其重寄生菌种类较多，涉及链格孢、镰刀菌、枝孢、拟盘多毛孢、木霉的种及粉红单端孢，虽然它们对锈菌都有一定的控制作用，但不同属及同属不同种的菌株对锈菌寄主的伤害差异很大，因此对那些严重伤害寄主植物的菌株，不能将其直接用于生物防治，但其活性成分值得进一步研究。

已有的研究表明，重寄生菌作为生防菌在野外防治某些植物锈病效果显著，具有很好的开发应用前景[15-18]。本研究对筛选获得的石楠锈孢锈重寄生菌的部分菌株在室内进行了接种试验，发现拟盘多毛孢SYP22菌株和枝孢SYC23菌株接种对锈菌寄主石楠没有伤害且能在石楠锈孢锈的锈子器上很好地生长并能有效破坏锈子器及锈孢子，具有优良生防菌的特点。由于本研究仅进行了室内接种试验，野外表现是否与其一致还有待进一步研究。此外，针对它们是否对其它锈菌也有相同作用，笔者用SYC23菌株的孢子悬浮液，接种了茶藨生柱锈和梨胶锈(Gymnosporangiumharaeanum)的锈孢子堆以及竹秆锈(Stereostratumeortieioides)的冬孢子堆和夏孢子堆，发现它们均能在这些锈菌孢子堆上萌发并正常生长，表明实验室条件下该菌株也能利用其他锈孢子作为养分生长，因此推测其对其他锈菌也应有一定作用，值得进一步研究。

重寄生菌的作用机理主要是通过分泌几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶破坏寄主菌细胞壁的骨架结构导致细胞死亡，或分泌毒素物质破坏寄主菌细胞膜的完整性导致细胞内部结构改变而引起细胞死亡，或既分泌胞壁降解酶也产生毒素共同破坏寄主菌[19-21]。本研究中SYC17、SYC23、SYC24和SYT01菌株均能破坏锈孢子壁，导致细胞质外溢，说明它们也能够分泌细胞壁降解酶,而其它菌株处理后的锈孢子细胞壁未受到明显破坏，但内含物浓缩且能被台盼蓝染色，表明它们可能以分泌的毒素物质使锈孢子失活。因此，本研究分离得到的石楠锈孢锈菌重寄生菌的寄生机理存在着一定差异，后续应从生物学特性和重寄生机理两方面对筛选获得的菌株进行更深入地研究，进而筛选出有应用前景的重寄生菌，为植物锈病的生物防治奠定基础。

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收稿日期：2015年1月25日。

第一作者简介：李梦婕，女，1990年1月生，西南林业大学生命科学学院，硕士研究生。E-mail：148336965@qq.com。通信作者：陈玉惠，西南林业大学生命科学学院，教授。E-mail：cyh196107@126.com。

1)云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目(50097505)。

责任编辑：程红。