大花四照花种子休眠解除过程中种皮和胚乳结构变化1)

周健　代松　钱存梦　苏友谊　李淑娴

(南京林业大学，南京，210037)



大花四照花种子休眠解除过程中种皮和胚乳结构变化1)

周健代松钱存梦苏友谊李淑娴

(南京林业大学，南京，210037)

摘要为探讨种皮、胚乳对大花四照花种子萌发的影响，以不同解除休眠处理后大花四照花种子为材料，开展了种皮透水性试验，并分别对其种皮和胚乳进行了扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察。结果表明：大花四照花种皮存在透水性障碍。扫描电镜观察发现，其种皮由外到内依次为表皮层、栅栏层、薄壁细胞层以及纤维细胞层。表皮层由多层排列紧密的厚壁细胞组成。栅栏层则由单层紧密排列的长柱状大石细胞构成，栅栏层可能是阻碍种子吸水的主要原因。酸蚀和低温层积对种皮结构都会产生一定影响。低温层积处理能破坏种皮表层结构，同时还能改变内部栅栏层细胞结构，种子低温层积90 d后，种皮出现裂缝直达内部薄壁细胞层。透射电镜观察发现，低温层积过程中，胚乳细胞内大分子营养物质不断降解，细胞内物质代谢速度逐渐加快，低温层积90 d，营养物质基本降解，线粒体、内质网、高尔基体等细胞器相继出现，种子休眠解除。浓硫酸酸蚀能加快大花四照花种皮结构的改变和胚乳细胞内物质代谢，促进该种子休眠的解除。

关键词大花四照花；种子休眠；种皮；胚乳；细胞结构

分类号S722.1

Ultrastructure Changes of Seed Coat and Endosperm onCornusfloridaSeed during Dormancy Breaking//

Zhou Jian, Dai Song, Qian Cunmeng, Su Youyi, Li Shuxian

(Nangjing Forestry University, 210037 Nanjing, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：34-38.

In order to investigate the effect of seed coat and endosperm on the germination ofCornusfloridaseeds, the ultrastructure of seed coat and endosperm ingredients ofC.floridaseed with different treatments was systematically investigated by using scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM), combining with the study of water permeability. Results of water uptake revealed the seed coat ofC.floridcould retard water uptake. By SEM images, from the exterior to the interior, the seed coat ofC.floridconsisted of four layers: the epidermal layer, the palisade layer, the parenchymatous layer and the fibrocyte layer. The epidermal layer consisted of multilayer sclerenchymatous cell. The palisade layer consisted of a monolayer macrosclereids with thick walls elongated longitudinally, and it may be the main barrier controlling the entrance of water through seed coat. Both of cold stratification and acid etching could change the seed coat structure ofC.florid. The epidermal layer and the palisade layer ofC.floridseed coat were damaged after treated by concentrated sulphuric acid. Cold stratification could destroy the out layer ofC.floridseed coat and change the structure of palisade layer to some extent. When seeds were cold stratified at 5 ℃ for 90 d, the cracks were appearing through the epidermal layer and the palisade layer. By TEM, with theC.floridseed dormancy released, macromolecule nutrients in the endosperm gradually decomposed and metabolism boosted. When seeds were cold stratified for 90 d, nutrients in the endosperm gradually decomposed, mitochondria, endoplasmic reticulum, golgi apparatus appeared, and its dormancy was broken. In addition, proper sulfuric acid treating could accelerate the break ofC.floridseed dormancy by expediting the change of seed coat structure and the metabolism of endosperm cell.

KeywordsCornus florida; Seed dormancy; Seed coat; Endosperm; Cell structure

大花四照花(Cornusflorida)为山苵萸科(Cornacease)山茱萸属(Cornus)四照花亚属落叶乔木，又名多花梾木，多花狗木。大花四照花原产于北美洲东部，喜湿润半阴的环境，早春开花，伞形花序，野生种外面的4个苞片刚开始开放时为绿色，后逐渐变为白色，为适应观赏的需要，又培育出苞片为粉红色或大红色的品种。其叶片光亮，入秋变红，留存树上达1月有余。秋天果实呈鲜红色，因此，大花四照花是集观花、观叶、观果于一体的园林绿化树种[1-3]。

大花四照花种子具有深休眠习性。以往的研究表明，种皮吸水障碍是四照花类植物种子休眠主要原因之一[4-5]，低温层积处理、浓硫酸酸蚀均利于该类种子休眠的解除[6-9]，如Liu et al.[10]在研究中发现，采用赤霉素浸泡后再低温层积90 d或先用浓硫酸酸蚀10 min，再结合赤霉素浸种、低温层积60 d的处理，能有效解除大花四照花种子休眠。种子休眠解除过程中种皮结构和胚乳细胞内含物均会发生一系列的变化[11-12]，但目前还没有从细胞结构变化的角度对大花四照花种子休眠解除的机理进行研究。本研究拟对大花四照花种子休眠解除过程中种皮和胚乳细胞结构进行观察与分析，从微观的角度探讨该种子休眠破除机制及浓硫酸对种子休眠解除的影响，为更好的解除其休眠提供一定的理论依据。

1材料与方法

试验所用种子从美国田纳西州进口，购回后保存于冰箱0～5 ℃。

种皮透水性测定：随机数取30粒供试种子，3个重复，将其置于装有清水的烧杯中浸种，每12 h取出种子，擦干表面水分，用千分之一天平称质量后重新浸入水中，重复之前的操作，直至种子吸水饱和，按下式计算种子的吸水率，绘制吸水曲线。

解除种子休眠：参考Liu et al.[10]的方法解除大花四照花种子的休眠，具体步骤为取供试种子先用500 mg·L-1的赤霉素溶液浸种72 h，再将V(种子)∶V(湿沙)=1∶3混合后低温(0～5 ℃)层积，每30 d取出部分种子进行电镜观察直至层积90 d；将种子放入浓硫酸中酸蚀10 min，浸泡过程中不断搅拌种子，结束后用流水冲洗24 h，再在500 mg·L-1赤霉素溶液中浸种72 h，低温层积60 d后取出进行电镜观察。处理过程中赤霉素溶液每12 h需更换1次；以未经任何处理的种子作为对照。

不同处理后种皮结构的扫描电镜观察：随机数取上述各不同处理的种子，借助扫描电镜(SEM)对种皮表面和纵切面进行观察，具体方法如下：

样品用70% FAA固定液固定→乙醇系列脱水(30%-50%-70%-90%-100%)→临点干燥仪(EMITECH K850)干燥→粘样、离子溅射仪(Hitachi E-1010)喷金→置于FEI Quanta 200扫描电镜下观察并拍照。

不同处理后胚乳组织的透射电镜观察：随机数取上述各不同处理的种子，去除种皮，取近胚根部胚乳，按朱莉伟等[13]的方法对胚乳细胞进行透射电镜(TEM)观察并拍照。

2结果与分析

2.1种子透水性测定结果

大花四照花种子吸水缓慢，浸种12 h时吸水率为6.73%，浸种72 h时种子吸水基本饱和，但此时的吸水率也仅为12.17%。说明该种子的种皮存在透水障碍，对种子萌发会产生一定的影响。

2.2种子表面及纵切面扫描电镜观察

由图1可知，大花四照花的种皮较厚，骨质，且高度木质化(图1a)，种皮的表面较为平整，局部有凹陷(图1b)。由图1c可知，大花四照花种皮主要由四部分组成，由外向内依次为表皮层、栅栏层、薄壁细胞层、纤维细胞层。其中，表皮层细胞角质化且凹凸不平，栅栏层则由一层长柱状且排列紧密的栅栏细胞组成，是水分进入种子的主要屏障，同时增加了种皮的厚度和硬度[14]。薄壁细胞层与纤维细胞层之间没有明显的分界线。栅栏层细胞的长轴多与种子表皮层垂直，而薄壁细胞长轴则平行于表皮层。角质化表皮层和栅栏层的存在以及栅栏细胞与薄壁细胞这种交错排列可能是造成大花四照花种皮透水性差的主要原因。

以往的研究表明，酸蚀和低温层积处理均能对种皮结构产生一定的影响[15-16]。大花四照花种子经低温层积30 d后，种皮表面出现破损(图1d)，种皮内部结构并没有明显变化(图1e)。低温层积60 d后，种子表面破损加剧并出现明显裂缝(图1f，图1g)，且裂缝直达栅栏层，此时栅栏层细胞排列相对疏松，纤维细胞出现破裂(图1h)。低温层积90 d后，种皮栅栏层出现裂缝直达薄壁细胞层(图1i)，薄壁细胞中包含有晶体物质(图1j)。浓硫酸酸蚀10 min并经赤霉素浸泡后再低温层积60 d的种子，种皮表面也出现明显破损(图1k)，表皮层被完全腐蚀，栅栏层也遭到一定程度的破坏，栅栏细胞排列相对疏松(图1l)，而浓硫酸对栅栏层一定程度的破坏可能是这一处理能促进大花四照花种子萌发的主要原因。

2.3不同处理后大花四照花种子胚乳细胞内含物观察

不同处理后大花四照花种子胚乳细胞内含物变化如图2所示。未处理的大花四照花种子胚乳细胞内脂滴含量较多，充盈着整个细胞，脂滴之间存在较大块状的高电子致密物质，细胞核清晰可见，核仁明显，细胞间存在明显的胞间连丝，为细胞间的物质运输和信息传递提供了保障(图2a、图2b)。种子经低温层积30 d后，高电子致密物质基本降解，脂滴呈块状或颗粒状，细胞核清晰可见(图2c)，此时细胞中已有少量线粒体存在(图2d)。低温层积60 d后，胚乳细胞中脂类物质继续降解消融形成较大块状，并且由于脂滴的不断降解，形成了很多明显的空洞，细胞壁扭曲(图2e)，细胞中线粒体数量明显增多(图2f)。种子低温层积90 d时，胚乳细胞中储存的营养物质基本降解，胞间连丝、细胞核依然清晰可见(图2g)，内质网、高尔基体、线粒体等细胞器增多，结构更加完整(图2h)，表明此时细胞内物质代谢活动加强，种子休眠基本解除，这与Liu et al.[10]的发芽试验结果相一致。浓硫酸酸蚀10 min，再在500 mg·L-1赤霉素中浸种72 h后再低温层积60 d的种子，部分胚乳细胞中脂滴已降解融合成较大块状，部分细胞中脂滴已完全降解(图2i)，其营养物质降解程度明显大于直接赤霉素浸泡后低温层积60 d的种子。胚乳细胞中细胞核、内质网、线粒体等清晰可见(图2j)。

Ep.表皮层；Pl.栅栏层；P.薄壁细胞层；F.纤维细胞层；Cr.晶体物质；a.对照组种子纵剖结构(bar=4 mm)；b.对照组种皮表面(bar=100 μm)；c.对照组种子纵剖结构(bar=500 μm)；d.赤霉素浸种72 h后低温层积30 d种子表面(bar=100 μm)；e.赤霉素浸种72 h后低温层积30 d种子纵剖面(bar=500 μm)；f、g.赤霉素浸种72 h后低温层积60 d种子表面(bar=4 mm、bar=100 μm)；h.赤霉素浸种72 h后低温层积60 d种子纵剖面(bar=500 μm)；i、j.赤霉素浸种72 h后低温层积90 d种子纵剖面(bar=400 μm、bar=100 μm)；k.浓硫酸酸蚀10 min，赤霉素浸种72 h后低温层积60 d种子表面(bar=100 μm)；l.浓硫酸酸蚀10 min，赤霉素浸种72 h后低温层积60 d种子纵剖面(bar=500 μm)。

图1不同处理后四照花种子种皮表面及纵切面结构

3结论与讨论

种子萌发必须经过水分吸收、酶活化以及胚生长三个阶段，其中一个或几个阶段受到影响便可能引起种子休眠[17]，而种皮结构会影响种子对水分的吸收，进而影响种子的正常萌发[18]。物理性休眠便是由于种皮对水分和氧气的不透性造成的，而种皮的不透性主要是因为种皮的栅栏状厚壁细胞和角质层的存在[19-20]。本次种子吸水测定结果显示，大花四照花种皮存在透水性障碍。扫描电镜观察发现，该种子的种皮坚硬厚实，存在较厚的角质化表皮层和致密的栅栏层，这增加了种皮的厚度和硬度，同时也阻碍了种子对外界水分的吸收。因此，种皮效应是引起大花四照花种子休眠的原因之一。

N.细胞核；P.胞间连丝；BG.高电子致密物质；L.脂滴；CW.细胞壁；M.线粒体；Er.内质网；G.高尔基体；a、b.对照组种子胚乳细胞透射电镜(bar=50 μm、bar=10 μm)；c、d.赤霉素浸种72 h后低温层积30 d种子胚乳细胞透射电镜(bar=100 μm、bar=10 μm)；e、f.赤霉素浸种72 h后低温层积60 d种子胚乳细胞透射电镜(bar=100 μm、bar=10 μm)；g、h.赤霉素浸种72 h后低温层积90 d种子胚乳细胞透射电镜(bar=50 μm、bar=10 μm)；i、j.浓硫酸酸蚀10 min再经赤霉素浸泡72 h后低温层积60 d种子胚乳细胞透射电镜(bar=100 μm、bar=50 μm)。

图2不同处理后大花四照花种子胚乳细胞内含物观察

种子休眠解除是一个复杂的形态和生理变化过程，在这一过程中，种皮结构和胚乳细胞内含物均会发生显著变化，而这种变化可能直接影响到种子休眠的解除[21]。本研究结果显示，随着低温层积时间的延长，大花四照花种子种皮表皮层逐渐破损并出现明显裂缝，栅栏层细胞排列也越来越疏松，种子休眠解除后，种皮裂缝继续加大并直达种皮内部薄壁细胞层，说明低温层积能有效解除大花四照花种皮的机械障碍，促进种子的萌发。以往研究表明，浓硫酸处理能增加种皮透性，利于种子萌发[22-23]。本试验结果显示，大花四照花种子先用浓硫酸酸蚀10 min，再采用赤霉素浸种并结合低温层积60 d的处理，其种皮表皮层已被完全腐蚀，栅栏层也遭到一定程度的破坏，细胞排列也较为疏松，与低温层积60 d的种子相比较可知，浓硫酸能明显促进该种子种皮结构的变化，加快其种皮障碍的解除，进而促进种子萌发。

胚乳是一种营养组织，其细胞中积累了大量的碳水化合物、蛋白质和脂肪等大分子营养物质[24]。在种子休眠解除过程中，为提供种子萌发所必须的养分，种子体内贮存的营养物质如淀粉会逐渐水解减少，脂类物质也会消融降解[25]。本试验结果显示，未处理的大花四照花种子胚乳细胞中含有较多脂滴和高电子致密物质，在低温层积过程中，高电子致密物质逐渐降解消失，脂滴也逐渐降解消融，各细胞器则逐渐出现，表明胚乳细胞中物质代谢活动加强，使营养物质不断分解，为种子萌发提供必需的养分。同时，经浓硫酸酸蚀并低温层积60 d的种子，胚乳细胞营养物质降解程度明显大于直接低温层积60 d的种子，表明浓硫酸酸蚀10 min能加快大花四照花种子休眠的解除。

种子休眠是植物为适应周边复杂的环境条件而形成的一种生理生态特征，种子休眠的解除也会伴随着一系列复杂的生理生化变化，如植物激素含量、酶活性、含水量等。本次仅从种皮结构和胚乳细胞内含物的变化这一角度对大花四照花种子休眠解除过程进行了研究，旨在了解其种子萌发进程，为今后该种子休眠机理的研究以及更好的解除其休眠提供一定的理论依据。

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收稿日期：2015年9月22日。

第一作者简介：周健，1990年12月生，南京林业大学南方现代林业协同创新中心，硕士研究生。E-mail：z_jian646896@163.com。通信作者：李淑娴，南京林业大学林学院，教授。E-mail:shuxianli@njfu.com.cn。

1)国家自然科学基金(31270711)、江苏省青蓝工程创新团队、江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。

责任编辑：任俐。