改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞

华　亮，朱　玲，钱志强，岳　云， 李叶丽，杨丹莉

(遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义　563099)



技术与方法

改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞

华亮，朱玲，钱志强，岳云， 李叶丽，杨丹莉

(遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 建立改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)。方法 将SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒。在无菌条件下剖开胸腹腔，取出大鼠的心肺组织，然后用非体式显微镜分离方法分离出肺动脉血管段，去除肺动脉血管外层纤维结缔组织、破坏血管内膜层内皮细胞后，用组织块贴壁法培养PASMCs，并传代、冻存和复苏，倒置相差显微镜观察细胞形态，普通免疫细胞化学法和免疫荧光法进行细胞鉴定。结果 大鼠PASMCs呈典型的“峰-谷”样生长状态，细胞形态呈梭形。α-SM actin蛋白在培养的大鼠PASMCs为阳性表达，传至第4代的PASMCs成活率可达98%，生长形态未见异常改变。PASMCs细胞从-80 ℃冰箱中取出复苏后，生长状态良好，形态、结构稳定。结论 用改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs，较传统组织块贴壁法更简单，培养效率高。

[关键词]组织块贴壁法；肺动脉平滑肌细胞；原代培养；大鼠

肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)是肺动脉血管重要的组成部分之一，PASMCs的结构和功能对肺动脉舒张和收缩功能的调节，维持低阻高排的肺循环正常生理功能起重要作用。建立体外大鼠原代PASMCs的培养体系，为肺动脉高压等肺血管疾病发病机制、防治手段的研究提供了重要基础和研究方法[1-2]。原代培养PASMCs的方法包括组织块贴壁法和酶消化法[3]。与酶消化法相比较，组织块贴壁法实验成本更低廉。然而传统的组织块贴壁法要求在体视显微镜下进行、直接剥离血管外的纤维组织获取肺动脉，操作复杂而且具有一定的难度[4]。本研究用改良前处理的组织块贴壁法培养出形态结构良好、细胞活力高的PASMCs。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠10只，重230～270 g，购自于第三军医大学大坪医院实验动物中心，许可证号:SCXK(军)2012-0011。

1.2实验试剂和仪器高糖DMEM、胎牛血清均购自GIBCO公司，青链霉素(双抗)购自Hyclone公司，胰蛋白酶、Hepes、DMSO均购自Solarbio公司，PBS粉末、山羊血清购自北京中杉金桥生物技术公司，4%多聚甲醛溶液、Mouse Anti-a-Smooth Muscle Actin购自BOSTER公司，抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒购自基因科技(上海)有限公司，FITC标记的羊抗小鼠二抗、DAPI购自北京博奥森生物技术有限公司。

超净工作台(YJ-1450)购自苏州净化设备厂，CO2孵箱(FORMA-3131)购自美国Thermo公司，高压消毒锅(ES-315)购自TOMY公司，倒置显微镜(IX73)购自日本OLYMPUS公司，离心机(SC-3610)购自美国Beckman Coulter 公司，-80 ℃超低温冰箱(DW-86L486)购自Haier BIO-MEDICAL公司。

1.3大鼠PASMCs的组织块贴壁法原代培养

1.3.1分离大鼠肺动脉血管颈椎脱臼法处死大鼠后断头(每次1只)，将其浸泡于盛有75%乙醇中10～20 min，取出后置于超净工作台，剪开胸腔，暴露心肺组织。在玻璃平皿下放一消毒后的冰袋(喷洒酒精后，放入超净台，紫外线照射30 min)。更换手术器械，用镊子轻提双肺的下叶，注意不能剪断食管，取出心肺组织，置于装有1%双抗的PBS溶液的玻璃平皿中，漂洗2～3次，除去心脏和肺门周围的组织，将漂洗过后的左右肺叶放入另一个盛有1%双抗的PBS溶液的玻璃平皿中。更换手术器械，用2把眼科弯镊，顺着肺组织的血管走向将肺动脉外纤维结缔组织挑开，被弯镊挑开的肺组织会吸收PBS而变得膨大松软。更换手术器械，用2把弯镊轻轻分离去除肺动脉血管周围的肺组织，将分离干净的肺动脉血管转移至另外一个盛有1%双抗的PBS溶液玻璃平皿中。另用2把弯镊，将血管外周的筋膜等物质去除干净，用1把眼科剪，剪去一、二级肺动脉主干获得远端肺动脉分支，将肺动脉从靠近肺门顶端的部分将肺动脉剪开，用弯镊较钝的弯曲部将剪开后肺动脉血管的内皮细胞面从上向下轻轻刮3～5次，以达到刮落内皮细胞的作用。

1.3.2大鼠PASMCs组织块贴壁法将剪开的肺动脉血管转移至盛有无血清高糖DMEM培养基的玻璃平皿中，更换手术器械，用1把眼科镊和1把眼科剪，将肺动脉血管剪成若干个血管条。将血管条转移至另一个无血清的培养基中，更换手术器械，用眼科剪将血管条组织剪碎(面积约1 mm2)，用弯头吸管以3～5块/cm2密度将组织块贴于25 mL培养瓶底壁上，取2 mL含20%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基加入培养瓶内(注意：培养基不能与组织块接触)，再加入20 μL的青链霉素溶液。将培养瓶置37℃，5%CO2，湿度80%孵箱(组织块贴壁面朝上)。5 h后将培养瓶原位缓慢翻转，使组织块完全均匀浸入培养基中静置5 d。如发现培养基由红色变成金黄色说明营养成分减少，即可更换培养基液。5～7 d后，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，可见植块周围形成“生长晕”，约10 d左右相邻的“生长晕”汇合成片，待其面积达培养瓶80%即可传代。

1.3.3大鼠PASMCs的传代培养用玻璃吸管轻轻刮组织块，使其与培养瓶脱离后将含组织块的培养基弃去(此步骤仅用于首次传代)，用PBS液清洗，每次加入2 mL PBS溶液，冲洗3次。随后吸取1 mL 0.25%胰蛋白酶液，将培养瓶置倒置显微镜下观察，当细胞成片收缩、体积变圆时，立即弃胰酶并加入10% FBS的培养液终止消化，反复轻轻吹打将细胞从瓶壁吹落后分装成2瓶继续培养。3～4 d后观察细胞生长面积达培养瓶80%时即表示又可传代。

1.4PASMCs的鉴定

1.4.1免疫细胞化学法鉴定选用第3代培养的细胞，消化细胞后以104～105个/mL密度的细胞悬液接种到放有盖玻片的6孔板中，每个盖玻片上加入500 μL的细胞悬液。再用10%FBS的培养基填充盖玻片周围的空隙，将6孔板平稳放入CO2孵箱中培养24 h。免疫细胞化学法鉴定步骤如下：细胞贴壁后，取出6孔板，吸弃培养基，4%多聚甲醛室温固定15 min，0.3%Triton-X100室温透化破膜10 min，用针头将盖玻片挑起置于瓶塞上；山羊血清室温封闭30 min，甩干山羊血清后滴加一抗 α-SMactin 200 μL(工作液浓度1∶100) 4 ℃冰箱过夜，15 h后将爬片从4 ℃取出复温20 min，甩干一抗冲洗后滴加二抗原液室温反应35 min。上述操作过程每步用PBS漂洗5 min×3次。冲洗后将6孔板在倒置显微镜下滴加DAB(工作液浓度1∶50)染色5～8 min、双蒸水冲洗后苏木素轻度复染、双蒸水冲洗后镜下拍照。

1.4.2免疫荧光细胞化学法鉴定与免疫细胞化学法不同之处在于与一抗反应结束后，避光环境下滴加FITC标记的羊抗小鼠二抗(1 μL：50 μL PBS)室温反应70 min，经PBS漂洗5 min×3次后滴加DAPI避光反应10 min复染核，PBS漂洗5 min×3次，洗去DAPI后拍照。

1.5PASMCs存活率的测定取第4代消化传代细胞的细胞悬液50 μL，加入0.4%台盼蓝液50 μL，混匀后吸取20 μL于细胞计数板的孔内，在细胞计数仪内读取细胞悬液的浓度和活细胞比例。

1.6PASMCs的冻存和复苏冻存步骤：选择对数生长期的第3～4代的细胞，在冻存前24 h给细胞换培养液。用胰蛋白酶将细胞消化下来后制备成细胞悬液，吸取细胞悬液于15 mL离心管中，1 000 rmp离心10 min，吸出上清液，加入1 mL(含20%FBS、10%DMSO的DMEM培养液)，吹打均匀后转移至高压灭菌好的冻存管中。贴上封口膜密封保存，室温放置10 min，4℃放置30 min，-20 ℃放置2 h，最后转移至-80 ℃冰箱(一个月内复苏)或液氮罐长期保存。

当需要用细胞时，对细胞进行复苏。将冻存管从冰箱里取出后，放入盛有37℃水的烧杯中迅速摇晃，经酒精消毒后将冻存管放入超净台中，然后迅速将细胞转移至无菌离心管中。加入3 mL 10%FBS的培养基，1 000 rmp离心10 min，在超净台中吸出上清液，然后再加3 mL10%FBS的培养基，吸打混匀后转移至细胞培养瓶中。将培养瓶置37 ℃，5%CO2，湿度80%孵箱。24 h后观察细胞的贴壁情况。

2结果

2.1获取肺动脉组织块在动物处置室将雄性SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后在无菌操作台中操作，最终获取肺动脉组织块，具体操作流程如图所示(见图1)。

A：获取肺组织；B：肺组织因吸附PBS液而膨大；C：祛除纤维结缔组织后的肺动脉；D：获取肺动脉； E：剪去一、二级肺动脉主干获得远端肺动脉分支； F：刮落肺动脉内皮细胞。 图1　获取肺动脉的操作流程图

2.2细胞形态学观察在倒置显微镜下观察原代培养的PASMCs生长情况，发现原代培养第5天可见PASMCs贴壁生长，细胞大小不等，形态多样(梭形、多角形、不规则型)(见图2A)。第8天左右细胞交织成网状(见图2B)，10 d左右多数细胞呈长梭形，胞浆丰富，有分支状突起，细胞平行排列成单层，或部分区域多层重叠生长，高低起伏，可见细胞成“峰、谷”样排列(见图2C)。传代后的细胞生长较快，2～3 d即可长满细胞培养瓶，并保持上述形态学特征和生长特点。经反复传代后，第4～8代均可保持良好的形态结构以及功能。

A:第5天；B：第8天；C：第10天。图2　改良组织块贴壁法培养的PASMCs不同时间段的生长状态(×100)

2.3肺动脉平滑肌细胞的鉴定据文献报道，血管中的α-actin为细胞中6种肌动蛋白亚类之一，在血管平滑肌中特异性表达，具有收缩功能(SMCs具有收缩表型的重要标志物)，为肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分[5]。细胞经免疫细胞化学法染色后，在高倍镜下可见细胞核用苏木素染色后呈淡蓝色，卵圆形居中，胞质内可见大量棕色，说明α-SMactin蛋白呈阳性表达(见图3A)。细胞经免疫荧光化学法染色后，在高倍镜下可见细胞核经DAPI染色后呈蓝色，卵圆形，胞质内可见大量的绿色，说明α-SMactin蛋白呈阳性表达(见图3B)。

A: PASMCs免疫细胞化学法染色(×400); B: PASMCs免疫荧光化学法染色(×320)。图3　肺动脉平滑肌细胞的鉴定结果

2.4传代细胞成活率选用第4代的PASMCs台盼蓝染色后，经细胞计数仪测定出活细胞的数量占98%，说明细胞成活率高。而且传至第4代以后的细胞生长形态良好、传代后的细胞在12 h内能大部分贴壁，贴壁时间短、2 d左右可以长满整个培养瓶，生长速度快。

2.5细胞冻存与复苏当培养的细胞数量过多，短时间内无法对诸多的细胞进行处理，要求实验操作人员对细胞进行暂时性的冻存，并适时的进行细胞复苏以完成实验。细胞从-80 ℃冰箱中取出复苏后，细胞生长状态良好，细胞形态、结构稳定。复苏后的细胞在24 h内能大部分贴壁，贴壁时间短、3 d左右可以长满整个培养瓶，生长速度快。

3讨论

近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们对血管平滑肌细胞的增殖、凋亡、迁移、黏附和细胞外基质的合成和分泌等方面的认识不断深化。PASMCs是肺动脉血管的重要组成之一，其稳定的结构和功能在肺动脉血管舒张和收缩的调节中起重要作用。肺动脉高压是一种因内皮功能障碍、炎症免疫反应等因素引起的肺血管阻力进行性升高，最终导致右心功能衰竭、死亡的病理生理综合征[6-8]。相关文献报道，肺血管重构与PASMCs的异常增殖密切相关[9]。因此，建立培养体外大鼠PASMCs培养体系可为肺动脉高压等肺血管疾病提供良好的实验研究基础。

本实验运用改良的组织块贴壁法后能够获得形态、结构稳定、活细胞比例高、传代后贴壁时间短，生长速度快，甚至在细胞经冻存后的活性依然高，生长速度快的PASMCs。与传统的组织块贴壁法相比，本实验改良之处主要体现在以下几个方面：①传统的组织块贴壁法获取肺动脉血管的过程直接在盛有预冷PBS液的玻璃平皿中进行[10]；改良后的方法将装有肺血管组织的玻璃平皿置于冰袋上操作，更能持续维持组织低温，有利于保持肺血管的活性，有利于组织贴壁后PASMCs的生长。②传统的组织块贴壁法需要在体式显微镜下操作进行，延长了操作时间、增加了被污染概率；改良方法减少了该步骤，在无体式显微镜辅助下同样获取了完整的肺动脉，减少了实验操作时间。③在肺动脉的剥离过程中，传统方法是直接将血管外的纤维组织剥离，易撕裂远端的肺动脉血管，而且获得的肺动脉血管组织少，牵拉损伤严重；改良方法在获取肺动脉时通过用眼科镊从肺叶边缘起小心挑开血管周围的组织，肺组织因被破坏而吸收了大量PBS液体导致蓬松变软，然后再轻轻剥离血管的周围组织可获得完整牵拉损伤小的肺动脉血管。

改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs，得到生长活力高、形态稳定的PASMCs，并可以获得稳定的传代细胞，较原组织块贴壁法更简单，效率更高。

[参考文献]

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[收稿2016-02-14;修回2016-03-10]

(编辑：王福军)

Modified pretreatment tissue explants adherent method for primary rat pulmonary artery smooth muscle cells culture

HuaLiang,ZhuLing,QianZhiqiang,YueYun,LiYeli,YangDanli

(Department of Pharmacology,Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To set up a modified pretreatment tissue explants adherent method for primary rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) culture.Methods SD rat was sacrificed by cervical dislocation, and then was put into the beaker containing 75% alcohol for immersion disinfection. The chest was opened and the heart and lung were taken out under aseptic condition. The pulmonary artery segments were acquired with a non-stereo microscope separation method. The outer membrane of pulmonary artery trunk was separated and endothelial cells were damaged. PASMCs were cultured by the modified tissue explants adherent method. The PASMCs were then passaged, cryopreserved and resuscitated. The cellular morphology and typical growth conditions were observed with the inverted phase contrast microscope. Cell specificity was identified by methods of immunocytochemistry and immunofluorescence.Results PASMCs showed a typical "peak - valley" growth state and presented spindle shape. The protein expression of α-SM actin in the isolated cells was positive by the method of immunocytochemistry and immunofluorescence. The survival rate of the 4th generation of PASMCs was up to 98% by the cell counting detection method. The growth of passaged PASMCs was normal. The good growth state, stable morphology and structure of PASMCs were presented when cells were recovered from -80 ℃ freezer.Conclusion PASMC could be successfully cultured using the modified pretreatment tissue explants adherent method, and this method is easier and more efficient than the traditional method.

[Key words]tissue explants adherent method; pulmonary artery smooth muscle cells; primary culture; rat

[中图法分类号]Q813.1

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)02-0195-05

[通信作者]杨丹莉,女，博士, 教授, 硕士生导师, 研究方向: 心血管药理与免疫药理,E-mail:393707603@qq.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO:81360498)。