DDAH2C-449G基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死的相关性

刘洁　王前　郭艳敏　卢军栋　齐凡星

071000　河北保定市第一中心医院[刘洁　王前　郭艳敏(通信作者)　卢军栋　齐凡星]



DDAH2C-449G基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死的相关性

刘洁王前郭艳敏卢军栋齐凡星

071000河北保定市第一中心医院[刘洁王前郭艳敏(通信作者)卢军栋齐凡星]

【摘要】目的探讨DDAH2C-449G基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死(atherothrombotic infarct of brain)的关系。方法共纳入345例脑梗死患者和201例对照组人群，以DDAH2C-449G基因为遗传标志，采用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性技术(RFLP)检测DDAH2C-449G基因多态性。结果动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死GG基因型、G等位基因频率较对照组高(P<0.05)。结论DDAH2C-449G基因多态性可能与动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死发病有关，G等位基因可能是动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死的易感基因。

【关键词】AIS遗传基因DDAH2C-449G聚合酶链反应

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.004

近年来有研究报道，脑梗死患者的血浆中非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平增高，并且其增高的水平与高血压病、高血糖和高脂血症等危险因素呈正相关，这提示了ADMA与脑梗死有重要关系[1]。

有研究表明90%以上体内的ADMA经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)代谢，该酶的量和活性与DDAH2基因的多态性密切相关。研究发现，糖尿病、高血压病和高脂血症患者的血浆ADMA水平增高与DDAH2的转录、表达和基因多态性密切相关[2,3]。本研究对保定地区汉族人群DDAH2C-449G基因多态性的分布进行研究，以探讨DDAH2C-449G基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死之间的关系。

1资料与方法

1.1研究对象

收集2010年4月～2013年3月在保定市第一中心医院神经内科住院的脑梗死患者345例，其中男256例，女89例，年龄40～90岁，平均年龄(58.75±10.11)岁，均经头颅核磁共振成像(MRI)检查确诊为脑梗死，诊断均符合1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准[4]。对照组201例，来自保定市第一中心医院体检中心体检健康人群，其中男112例，女89例，年龄43～88岁，平均年龄(59.45±8.21)岁，与脑梗死组的年龄、性别相匹配，无脑血管病家族史，排除肝肾疾病、血液病、自身免疫性疾病、妊娠等疾病。所有研究对象均来自保定地区汉族人群，无血缘关系。

1.2方法

1.2.1收集2组血糖、血压及血脂水平。

1.2.2基因组DNA的提取及聚合酶链反应(PCR)取空腹12 h静脉血5 mL，肝素抗凝，常规酚/三氯甲烷抽提法提取基因组DNA。使用Primer3引物分析软件设计DDAH2C-449G引物，上游引物：5‘-GCGGAGAGAG GATGCTTAACT-3’，下游引物：5，- GCT CCT GTC GAC CTC ACT CT-3，。PCR反应体系：总体积为25 μL,模板DNA 1 μL，10×缓冲液2.5 μL，Tap酶0.5 μL(1U)，引物分别为1 μL(20 pmol)，dNTP 0.5 μL(10 mmol/L),用双蒸水补足至25 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，然后以下列温度和时间循环35次：94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，最后72 ℃充分延伸5 min。

1.2.3限制性片段长度多态性分析取PCR扩增产物10 μL，加入内切酶HpaII 1 μL(10 U/μL),10×Buffer 2 μL，用双蒸水补足至31 μL混匀，37 ℃水浴过夜，取酶切产物在2%琼脂糖凝胶板于0.5×TBE电泳缓冲液电泳检测酶切产物(110 V,30 min),用Eagle EyeII型图像分析处理系统观察电泳产物并拍照。

1.2.4基因型判定DDAH2C-449G片段扩增酶切产物：PCR扩增的DDAH2基因片段为389 bp的DNA片段，经HpaII限制性内切酶消化后可产生3种基因型，即GG型，酶切后仅有389 bp片段；GC型，酶切后有3条片段：389、243、146 bp；CC型，酶切后有两条片段：243、146 bp(图1)

1.2.5统计学处理采用SPSSl3．0软件，应用拟和优度检验分析两组对象基因型频率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡；DDAH2基因型及等位基因计数用直接计数法，并计算基因频率，两组间基因频率比较采用ⅹ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

图1 DDAH2基因C-449GPCR产物酶切后电泳图谱

2结果

2.12组临床指标比较脑梗死组的HDL-C水平明显低于对照组(P<0.05)；与对照组相比，脑梗死组血脂中的TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05)；脑梗死组的血糖及SBP和DBP水平均显著高于对照组(P<0.05)(表1)。

2.2脑梗死组与对照组DDAH2C-449G多态性分布比较脑梗死组GG基因型、G等位基因频率较对照组高(P<0.05)(表2)。

表2　脑梗死组与对照组DDAH2C-449G基因型频率

注：与对照组比较，*P<0.05

3讨论

DDAH2基因位于6p21.3上，有8个外显子和7个内含子。Jones等研究发现，DDAH2存在6个核苷酸多态性位点，5个位于启动子区，1个位于外显子上，分别为-1415G/A、-1151C、-1020C/G、-8716G/7G、-449C/G、618C/T。-1415G/A、-115lC/A、-449C/G的多态性在NCBI SNP数据库中编号分别是rs227259、rs805304、rs805305。除-8716G/7G外，所有多态性均为点突变。TATA盒能准确识别转录起点并促进转录，同时对转录水平有定量效应。由于DDAH2上游区域无TATA盒，启动子区核苷酸突变虽不能完全抑制启动子活性但使其活性降低。DDAH2基因的多态性影响DDAH2基因的转录、表达和DDAH的活性。Jones等发现DDAH2基因-8716G/7G基因多态性影响DDAH的基础转录，7G基因型上调DDAH2转录活性，降低ADMA水平，具有心血管保护效应。

表1　脑梗死组和对照组的血脂、血压、血糖水平比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05

ADMA是以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，由蛋白质甲基转移酶(PRMT)催化蛋白质或多肽中的精氨酸胍基甲基化，然后在蛋白水解酶的作用下，由甲基化蛋白水解而来。ADMA小部分经肝脏代谢和肾脏排泄，90%以上经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)代谢为胍氨酸和二甲胺。临床研究表明，败血症、高血压、高血脂和糖尿病患者的血浆ADMA浓度增高与PRMT活性增高和肝肾功能不全无明显相关，而与DDAH2的转录、表达和活性密切相关。DDAH酶的催化活性部位是一个cys-his-glu三连体结构，DDAH通过其第249位半胱氨酸残基上亲核的巯基攻击ADMA胍基上的氮代谢ADMA。

Jun-Hyun Yoo等[5]报道，血清ADMA水平增高与脑梗死发病密切相关，血浆ADMA升高是动脉粥样硬化一氧化氮依赖性内皮功能不全的早期标志，是心脑血管事件的独立预测因子[6]，而DDAH2C-449G基因多态性影响其血浆水平。有研究表明，高水平的ADMA不仅与L-精氨酸竞争内皮一氧化氮合酶以阻止内皮一氧化氮合成，导致一氧化氮依赖的内皮功能不全，血管张力增加，白细胞和血小板粘附、聚集，血管平滑肌增殖，而且其本身还诱导和促进机体产生自由基，参与内皮的“炎症因子瀑布”反应。ADMA90%以上经DDAH代谢为胍氨酸和二甲胺[7]。本研究从遗传角度出发，探讨DDAH2C-449G基因多态与脑梗死的相关性。

本研究发现DDAH2基因C-449G多态性与脑梗死有关，G等位基因可能是脑梗死的易感基因。本实验推测DDAH2基因C一449G位点多态性通过调节血浆ADMA的水平而影响脑梗死的发生。(1)动脉粥样硬化是动脉粥样硬化性脑梗死的病理基础，ADMA可能通过以下途径促进其发展：①ADMA作为内源性NOS抑制剂，使NO合成减少、导致N0依赖性内皮功能不全，促进脑梗死的发生发展；②ADMA水平的升高与机体自由基增加所导致的氧应激有关，而增加的ADMA又能通过NOS失偶联产生更多的自由基，从而形成一个恶性循环，加速内皮功能损伤及促进血管性疾病发展；③ADMA水平与TNF-a、C-反应蛋白等传统炎症因子存在明显关联，被认为是内皮炎症因子的潜在诱导物；(2)本研究结果显示脑梗死患者组中SBP和DBP水平均高于对照组(P<0.05)，这可能是由于高血压使动脉内膜内皮细胞间的连续性中断，内皮细胞回缩，使内皮下的组织暴露，促进和加重脑动脉粥样硬化；(3)本研究结果显示脑梗死患者组中TG、TC、LDL-C水平明显高于对照组(P<0.05)，而HDL-C水平明显低于对照组(P<0.05)，脑梗死组的血糖水平显著高于对照组(P<0.05)，这可能由于高血糖、高脂血症均能抑制DDAH酶的活性，使ADMA水平升高；ADMA通过抑制一氧化氮合酶，使一氧化氮合成减少，生物利用度降低，内皮功能下降，导致血管内皮依赖性血管舒张作用减弱和血管张力增高，血管壁增厚和血管内膜增生，从而加重脑动脉粥样硬化[8]。因此，降低脑梗死患者血浆ADMA水平，从而阻断其病理生理作用，对于防治脑梗死具有重要的理论和实践意义。

上述研究结果由于样本量小、入选标准、实验设计差别、不同人种、地区差异等因素的影响。所以本研究结论有待于更大量样本的试验研究加以验证。

参考文献

[1]Nishiyama Y,Ueda M.Katsura KI er al.ALsymmetric dimethylarginine(ADMA)as a possible risk marker for ischemic stroke[J].Neuro Sci,2010,290(1/2):12-15.

[2]Andreozzi F,Presta I,Mannino GC,et al.A functional variant of the dimethylarginine dimethylaminohydrolase-2 gene is asslciated with insuLin sensitivity[J].PLoS One,2012,7(4):e36224.

[3]Luenebur N,Maas R,Lieb W,et al.Polymorphisms in the promoter region of the dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 gene are associated with prevalence of hypertension[J].Nitric Oxide-Biology and Chemistry,2008,19(S):S40.

[4]李粲,韩莉娜,霍富元,等.2012年广州市海珠区居民脑卒中患病率及相关危险因素调查分析[J].热带医学杂志,2013,13(6):712-715.

[5]Yoo JH,Lee SC.Elevated levels of plasma homocyst(e)ine and asymmetric dimethylarginine in elderly patients with stroke[J].Atherosclerosis,2001,158(2):425-430.

[6]Wilson AM,Shin DS,Weatherby C,et al.Asymmetric dimethylarginine correlates with measures of disease severity, major adverse cardiovascular events and all-cause mortality in patients with peripheral arterial disease[J].Vascular Medicine,2010,15(4):267-274.

[7]Tran CT,Fox MF,Vallance P,et al.Chromosomal localizarion,gene structure,and expression pattern of DDAH:comparison with DDAH2 and implications for evolutionary origins[J].Genomics,2000,68(1):101-105.

(2015-12-10收稿2015-12-27修回)

Relationship between dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2C-449G dene polymorphism and atherothrombotic cerebral infarction

LiuJie,WangQian,GuoYanmin,etal.

FirstCentralHospitalofBaoding,Baoding071000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase 2C-449G Gene and atherothrombotic cerebral infarction. MethodsA total of 345 patients with ischemic stroke and 201 controls were enrolled in the study. DDAH2C-449G gene was chosen as the genetic marker. Polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) were used to detect DDAH2 gene polymorphism. ResultsGG genotype and G allele frequency in atherothrombotic cerebral infarct group were higher than those in control group (P<0.05). ConclusionDDAH2C-449G gene polymorphism may be related to the incidence of atherothrombotic cerebral infarction. G allele may be the predisposing gene of atherothrombotic cerebral infarction.

【Key words】Atherothrombotic cerebral infarctionGeneticsGeneDDAH2C-449GPolymerase chain reaction

【中图分类号】R743

【文献标识码】A

【文章编号】1007-0478(2016)02-0088-03