尿液血管内皮生长因子作为早期糖尿病肾病诊断的生物学标志物

赵 京 王晓阳 肖 静 刘 栋 刘章锁 赵占正

尿液血管内皮生长因子作为早期糖尿病肾病诊断的生物学标志物

赵 京1王晓阳2肖 静2刘 栋2刘章锁2赵占正2

目的：评估尿液血管内皮生长因子(uVEGF)能否作为诊断早期糖尿病肾病(DN)生物学标志物。 方法：选择2015年4月至10月于郑州大学第一附属医院就诊的2型糖尿病患者94例，分为正常白蛋白尿组(n=30)，微量白蛋白尿组(n=33)，大量白蛋白尿组 (n=31)，另选30例健康者作为对照组，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组uVEGF水平。各组患者病程、血清肌酐、尿酸、空腹血糖、糖化血红蛋白等用Logistic回归分析DN相关临床指标，ROC曲线评估灵敏度及特异性。 结果：与健康对照组uVEGF(18.44±0.73 pg/ml)相比，大量白蛋白尿组uVEGF(90.07±7.02 pg/ml，P<0.001)，微量白蛋白尿组uVEGF(75.88±9.60 pg/ml，P<0.001)和正常白蛋白尿组uVEGF(33.11±5.20 pg/ml，P=0.02)均显著升高。uVEGF与尿白蛋白(r=0.748，P<0.001)、病程(r=0.714，P<0.001)、血清尿素氮(r=0.466，P=0.004)、估算的肾小球滤过率(r=0.437，P=0.005)、血清肌酐(r=0.412，P=0.013)和总胆固醇(r=0.377，P=0.023)成显著正相关。ROC曲线示：uVEGF早期诊断DN的cut-off值为42.573 pg/ml，敏感度为94.7%，特异度为96.4%。 结论：uVEGF可作为早期DN诊断的生物学标志物。

糖尿病肾病 糖尿病 尿液血管内皮生长因子 尿白蛋白

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要并发症之一，DN发病率高达20%～40%[1-2]，是导致终末期肾病的主要原因。早期诊断DN对于延缓病情进展及临床防治具有重要意义[3]。现阶段微量白蛋白尿是诊断早期DN最佳指标,但尿白蛋白不能预测DN患者是否会发生肾功能的变化[4]。因此，寻找新的生物学标志物早期诊断DN具有重要意义。

DN主要病理特点之一是足细胞减少[5]，足细胞可产生多种血管生长因子，其中血管内皮生长因子(VEGF)在DN患者中升高，可能其参与DN的发生、发展[6]。本研究通过观察不同阶段T2DM患者uVEGF表达水平，评估uVEGF作为早期检测DN生物学标志物的可能。

对象和方法

研究对象 郑州大学第一附属医院2015年6月至10月住院治疗的T2DM患者94例,其中男性48例,女性46例,平均年龄(54.7±4.34)岁。

纳入标准 (1)T2DM诊断符合世界卫生组织制定的诊断标准[7]；(2)临床或肾活检病理符合DN特点，持续尿白蛋白定量≥30 mg/24h和(或)估计的肾小球滤过率(eGFR)<60 ml/(min·1.73m2)，并排除合并其他肾脏疾病的患者。

排除标准 (1)DN急性并发症、急慢性感染、发热、心肺疾病，肾功能进行性恶化行肾脏替代治疗者，原发或继发性肝、肾疾病和其他内分泌代谢疾病及其他严重器官疾病；(2)2周内使用过血管紧张素转化酶抑制剂和或血管紧张素受体拮抗剂等药物。

根据尿白蛋白排泄量(UAER)将研究者分为3组，正常白蛋白尿组(DN1)：UAER<30 mg/24h；微量白蛋白尿组(DN2)：30 mg/24h≤UAER<300 mg/24h；DN大量白蛋白尿组(DN3)：UAER≥300 mg/24h。正常对照组(NC)：健康体检者,无DN、高血压、肾脏疾病和内分泌等其他疾病。

研究方法 收集患者身高、体重，体质量指数(BMI=体重/身高2)，血压；记录空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)、eGFR、糖化血红蛋白(HbA1c)等临床指标，其中采用Cockcroft-Gault(C-G)公式计算eGFR；第一日晨起首次尿弃去，之后开始留取24h全部尿液(包括次日晨起首次尿)，记录尿总量，混匀后于自动生物分析仪测定每100ml尿液的蛋白量，进一步计算出24h尿总蛋白量。收集清晨中段尿10 ml，离心后取上清液，酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿VEGF (uVEGF)水平，试剂盒由全式金生物工程有限公司提供，检测仪器为Labsystem Multiskan Ascent 酶标仪。

统计分析 使用SPSS 19.0软件进行统计分析，连续变量采用均数±标准差表示，多组独立样本比较采用单因素方差分析，分类资料比较采用χ2检验，Pearson相关分析uVEGF与尿蛋白及其他临床指标相关性，单因素Logistic回归分析uVEGF及其他临床指标是否与DN发生相关，以α=0.05为检验水准。绘制uVEGF诊断DN的ROC曲线，确定Cut-off值、灵敏度及特异度。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结 果

一般临床资料特征 各组年龄、性别、BMI差异无统计学意义；DN病程、收缩压与舒张压有统计学意义(表1)。与CN组相比，DN1、DN2、DN3组患者TC显著升高(P<0.001)；与DN1组比较，DN3组eGFR、BUN、SCr及HbA1c显著升高(表1)；三组内比较，FPG及TC无统计学意义。

DN3组UAER、uVEGF、SCr、BUN与eGFR较DN1、DN2组显著升高，差异具有统计学意义(表1)；与DN1组相比较，DN2组eGFR、UAER和uVEGF显著升高(P<0.01)；与CN组比较，DN1组uVEGF显著升高(P<0.001)。

表1 各组研究对象一般临床资料特征

DN：糖尿病肾病；BMI：体质量指数；FBG:空腹血糖；uVEGF：尿液血管内皮生长因子；UAER：尿白蛋白排泄量；与对照组比较*P<0.05,**：P<0.01；#：与DM1组比较，P<0.05；&：与DM2组比较，P<0.05

uVEGF与DN患者一般临床资料相关性分析 Pearson相关分析，uVEGF与DN病程、TG、eGFR、BUN、SCr、HbA1c及UAER显著正相关，与年龄、BMI、SBP、FBG、及TC无相关性(表2)。

表2 uVEGF与糖尿病临床指标相关性

uVEGF：尿液血管内皮生长因子；BMI：体质量指数；FBG:空腹血糖;HbA1c：糖化血红蛋白；eGFR：估算的肾小球滤过率； UAER：尿白蛋白排泄量；SCr ：血清肌酐；BUN：血清尿素氮

单因素Logistic回归分析 单因素Logistic回归分析病程、FBG、TG、eGFR、BUN、SCr、uVEGF及 UAER与DN的发生相关(表3)。

表3 单因素Logistic回归分析

BMI：体质量指数；FBG:空腹血糖;HbA1c：糖化血红蛋白；eGFR：估算的肾小球滤过率； UAER：尿白蛋白排泄量；VEGF：血管内皮生长因子

uVEGF的ROC曲线分析 以24h尿白蛋白≥30 mg/24h为诊断DN金标准，构建ROC曲线评估uVEGF检测DN的灵敏度及特异性，uVEGF诊断DN患者ROC曲线下面积为0.965，Cut-off值为42.573 pg/ml，灵敏度为94.7%，特异度为96.4%(图1)。

图1 尿液血管内皮生长因子的ROC曲线分析

讨 论

DN是T1DM及T2DM严重的并发症，最终将发展至终末期肾病[8]。因此，早期诊断及防治DN对于逆转及延缓病情进展尤为重要[3]。

Petrica等[9]研究发现，uVEGF与UAER相关，与近端小管功能障碍标志物、糖基化终末产物(AGEs)、胱抑素C、eGFR相关，DN肾功能异常者uVEGF表达明显高于DN伴肾功能正常者。VEGF与DN病程成正相关，与T2DM患者高脂血症及靶器官损害有一定相关性[10]。本研究发现uVEGF与DN病程、TG、eGFR、BUN、SCr、HbA1c，特别是 UAER呈现显著正相关，与既往研究基本一致。

目前尿微量白蛋白作为诊断早期DN金标准，但对DN长期随访的研究中，肾功能下降的1 132例患者中有575例(51%)患者并未出现白蛋白尿，因此微量白蛋白尿诊断DN特异度和敏感度仍有不足[11]；此外，传统的危险因子并不能充分解释疾病的风险程度，替代侵入性活检的体液检测，如尿液检测来预测DN尚未明确证实[12]。VEGF是足细胞产生的生物标志物之一，主要在足细胞表达，通过旁分泌或自分泌的方式发挥生物学效应，通过促进血管生成，增强血管通透性，诱发细胞外基质沉积，肾小管基膜增厚及肾间质纤维化在DN肾脏纤维化及肾小球肥大中发挥重要作用[4]。已证实在DN的早期发展阶段尿VEGF表达上调，且在T2DM伴微量蛋白尿中VEGF及其受体增加水平与尿蛋白呈平行关系[7]。同样研究表明VEGF在DN中表达上调，甚至在DN伴正常蛋白尿时期已较正常对照组升高，说明uVEGF比尿白蛋白出现的更早，且随着DN病情进展逐渐增多[13]。本研究以尿微量白蛋白为标准确诊DN，ROC曲线表明在DN正常蛋白尿时期uVEGF已显著性升高，与既往研究一致，因此uVEGF可能作为检测早期DN的标志物。

早期DN患者uVEGF升高的原因目前仍未完全明确。可能为：(1)缺氧。研究表明缺氧状态下进行细胞培养，数小时后可观察到VEGF mRNA表达明显增多[14]；肾小球皮质及髓质在急性缺氧下近曲与远曲小管可直接结合缺氧诱导因子1，引起VEGF mRNA显著表达，在慢性肾脏血流减少时，间质细胞也可见VEGF mRNA的表达[15]。(2)高血糖。早期高糖环境激活蛋白激酶C及各种细胞因子如转化生长因子β、血管紧张素Ⅱ、纤维母细胞生长因子(FGF)等均可上调VEGF合成及分泌[7]。AGEs可剂量依赖方式灭火NO，抑制VEGF生成，但高血糖使AGEs增多，导致VEGF-NO解偶联，使得VEGF水平不受NO反馈调节，从而导致VEGF生成增多[16]。(3)足细胞损伤。DN发展早期主要表现足细胞数目减少，足突融合、消失，损伤的足细胞可释放大量胞内储存的VEGF[17]。

在DN早期，uVEGF显著增加，随DN病情进展逐渐增多，可作为其生物学标记物，预测DN的病情进展[4]。然而这些研究并未分析uVEGF预测早期DN的Cut-off值。我们的研究分析ROC曲线显示uVEGF预测DN的Cut-off值为42.573 pg/ml，灵敏度为94.7%，特异度为96.4%，但对于这个“节点”的诊断效力，需要我们进一步的大量临床研究验证。

小结：在早期T2DN患者中尿VEGF水平增加，uVEGF与DN病程的进展有显著相关性。uVEGF可能作为诊断早期DN生物标记物。已有研究表明VEGF在DN视网膜病变的作用，并将该认识应用于临床治疗，因此我们推测，抑制或阻断VEGF的作用也可作为防治DN的有效措施。

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(本文编辑 律 舟 子 慕)

Urinary vascular endothelial growth factor as an early diagnostic biomarker of patients with diabetic nephropathy

ZHAOJing1,WANGXiaoyang2,XIAOJing2,LIUDong2,LIUZhangsuo2,ZHAOZhanzheng2

1InstituteofClinicalMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China2DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

ZHAOZhanzheng(E-mail：zzzdoctor@139.com)

Objective：To evaluate the levels of urinary vascular endothelial growth factor(VEGF)in type 2 diabetic patients with different degrees of diabetic nephropathy (DN) and to assess the value of vascular endothelial growth factor in the early detection of DN. Methodology：Ninty-four patients with type 2 diabetes were enrolled into this study. They were divided into three groups: normoalbuminuria (n=30), microalbuminuria (n=33), and macroalbuminuria (n=31), according to their urinary albumin excretion, and 30 healthy persons were regarded as normal controls. Urinary VEGF levels were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay. Their clinical and laboratory data were collected. Results：The VEGF levels were significantly increased in macroalbuminuric (P<0.01)、microalbuminuric (P<0.01) and normoalbuminuric (P<0.01) diabetic patients compared to that control subjects (P<0.05). Correlation study revealed that VEGF levels were markedly positively correlated to urinary albumin (r=0.748,P<0.001), disease duration (r=0.714,P<0.001), serum urea (r=0.466,P=0.004), eGFR (r=0.437,P=0.005), serum creatinine (r= 0.412,P=0.013), and Total Cholesterol (r=0.377,P=0.023). Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis of uVEGF levels for early diagnosis and detection of DN revealed that the cut-off value of uVEGF was 42.6 pg/ml with 94.7% sensitivity and 96.4% specificity. Conclusion：The findings of the present study suggest that VEGF may be considered as a novel potential diagnostic biomarker for the early detection of diabetic nephropathy.

Diabetic Nephropathy Diabetes mellitus urinary VEGF Urinary Albumin

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.03.004

1河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室(郑州，450052)；2郑州大学第一附属医院肾内科

赵占正(E-mail：zzzdoctor@139.com)

2015-11-16

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