粪产碱杆菌D-氨基酰化酶的分离纯化及发酵条件优化

陶　金，倪孟祥

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)



粪产碱杆菌D-氨基酰化酶的分离纯化及发酵条件优化

陶金，倪孟祥

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

摘要：采用热激法将含粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因载体的质粒导入大肠杆菌，筛选重组子，对该工程菌产生的D-氨基酰化酶用Ni2+柱进行分离纯化；通过单因素实验优化D-氨基酰化酶的发酵条件。结果表明，纯化后的D-氨基酰化酶比活力为456.71 U·mg-1，纯化回收率为50%，纯化倍数为12.4倍；最佳发酵条件为：37 ℃通气培养至菌体浓度OD600值为0.6时，加入0.5 mmol·L-1诱导剂IPTG诱导5 h，在此条件下，D-氨基酰化酶酶活力为90.9 U·mL-1。

关键词：D-氨基酰化酶；粪产碱杆菌；分离纯化；发酵条件；优化

随着科技的进步和分析方法的发展，人们相继在动物、植物和微生物中发现了多种D-氨基酸，这些D-氨基酸在各领域中有着极其重要的作用[1]，如在医药领域被用来制备具有生物活性的多肽、半合成抗生素、酶抑制剂等药物；在农业领域被用来合成低毒高效、无公害且易被生物降解的杀虫剂；在食品添加剂领域被用作甜味剂合成的关键中间体[2-6]。D-氨基酸可通过D/L-氨基酸消旋体拆分、不对称化学合成法、发酵法、酶法合成[7]。其中酶法合成D-氨基酸以高效、快速、低成本、易于大规模生产等特点得到广泛应用[8]。研究发现，自然界中有多种酶可用于D-氨基酸的生产，如：N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(D-氨基酰化酶)、N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶、D-乙内酰脲酶、D-氨基酸酰胺酶、氨基酸氧化酶、蛋白酶、D-氨基酸氨基转移酶[1]。其中D-氨基酰化酶是一类专一性水解酶，它可以通过水解N-酰基-D-氨基酸得到高纯度的D-氨基酸，所以利用D-氨基酰化酶来生产D-氨基酸逐渐成为热点[9]。自从1952年科学家首次从土壤微生物中分离得到D-氨基酰化酶以来，目前已从粪产碱杆菌(Alcaligenes)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)、贪噬菌(Variovorax)、木霉菌(Trichoderma)和小细菌属(Micro-bacterium natoriense)等菌属中分离得到了D-氨基酰化酶[10]。作者在此将粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因导入大肠杆菌进行原核表达，再对该工程菌产生的D-氨基酰化酶进行分离纯化，并通过单因素实验对D-氨基酰化酶的发酵条件进行初步优化，拟为D-氨基酰化酶的大规模工业化生产奠定基础。

1实验

1.1菌种、试剂与仪器

菌种E.coliBL21(DE3)，自行保存。含粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因的重组质粒pET22b由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，宿主菌为Top10；氨苄西林(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、质粒小量提取试剂盒，上海生工生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯或色谱纯。

EPS-200型数显式稳压恒流电泳仪，上海天能科技有限公司；Allegra25R型高速冷冻离心机，美国Beckman公司；H1650-W型台式高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司；电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；HA-300MIT型全自动高压蒸汽灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；XO-650型超声波细胞破碎仪，南京先欧仪器制造有限公司；HL-2S型恒流泵，上海青浦沪西仪器厂。

1.2培养基

LB培养基(g·L-1)：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠10，pH值7.0。

1.3方法

1.3.1D-氨基酰化酶表达载体的转化

将含有粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因的表达载体pET22b从宿主菌Top10中提取出来，并将表达载体热激转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，Amp抗性平板筛选，得到重组菌。

1.3.2D-氨基酰化酶的诱导表达

挑选平板上重组菌的单菌落，接种于1 mL含100 mg·L-1Amp的LB培养基中于37 ℃培养过夜(约10～12 h)。取上述1 mL菌液接入100 mL含100 mg·L-1Amp的LB培养基中于37 ℃、220 r·min-1振荡培养至OD600值约为0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，于37 ℃、220 r·min-1振荡培养3 h后进行SDS-PAGE分析。

1.3.3D-氨基酰化酶可溶性分析

取诱导后菌液在4 ℃、4 000 r·min-1离心10 min，收集菌体沉淀称量湿重，按每克10 mL加入磷酸缓冲液，吹打混匀后于冰浴中超声破碎(破碎条件：输出功率300 W、破碎时间5 s、间隔时间5 s、次数200)。将悬浮液在4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液与沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.3.4D-氨基酰化酶的Ni2+柱纯化

超声破碎后的上清液用0.22 μm滤膜过滤后收集滤液，进行Ni2+柱层析。将管路系统中气泡完全排出，按照上柱注意事项将柱子连接至纯化系统中。用10 BV去离子水冲洗柱子，然后用10 BV的磷酸缓冲液平衡柱子，流速均为1 mL·min-1。取粗酶液上柱，流速减半。用10 BV的含低浓度咪唑的磷酸缓冲液洗柱子，洗去未挂柱的杂蛋白。用不同梯度的含高浓度咪唑的磷酸缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液，备用。洗脱后，依次用10 BV的结合缓冲液、10 BV的去离子水洗柱子，再用5 BV的20%乙醇平衡柱子，于4 ℃保存。将不同梯度的洗脱液进行SDS-PAGE分析，将含有目的蛋白的洗脱液超滤脱盐得到纯酶。

1.3.5蛋白含量的测定

以牛血清白蛋白(BSA)标准液绘制标准曲线，用紫外分光光度法测定蛋白含量[11]。

1.3.6D-氨基酰化酶酶活力测定

分别取D-蛋氨酸母液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于试管中，用去离子水补足至1 mL，各加入1 mL醋酸钠-醋酸缓冲液和1 mL茚三酮溶液，充分混匀后于沸水浴中放置15 min，自来水冷却后静置5 min，再加入3 mL 60%乙醇稀释，摇匀后测定A570值并绘制标准曲线。

取粗酶液200 μL于1.5 mL EP管中，依次加入700 μL Tris-HCl溶液、100 μLN-乙酰-D-蛋氨酸溶液，使酶液稀释5倍，终体积为1 mL；取纯化后酶液25 μL于1.5 mL EP管中，加入875 μL Tris-HCl溶液、100 μLN-乙酰-D-蛋氨酸溶液，将酶液稀释40倍，终体积为1 mL；对照为1 mL Tris-HCl溶液。将上述溶液于37 ℃水浴中反应30 min，室温下于12 000 r·min-1离心5 min。取1 mL反应液于试管中，加入1 mL醋酸钠-醋酸缓冲液和1 mL茚三酮溶液，充分混匀后于沸水浴中放置15 min，自来水冷却，静置5 min。再加入3 mL 60%乙醇稀释，摇匀后测定A570值。

酶活定义：在上述条件下，1 min 内生成1 μmol D-蛋氨酸所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

1.3.7发酵条件优化

通过单因素实验考察IPTG浓度、诱导时机、诱导时间对酶活力的影响，以优化D-氨基酰化酶的发酵条件[12]。

2结果与讨论

2.1D-氨基酰化酶的诱导表达

D-氨基酰化酶的分子量为55 kDa，His标签的分子量为3 kDa，所以表达的蛋白分子量约为58 kDa。重组菌经诱导后，用10%的SDS-PAGE进行检测，结果如图1所示。

M.蛋白质标记　1～5.IPTG诱导3 h的pET22b　6.pET22b

从图1可以看出，重组菌经过IPTG 3 h的诱导后，在约58 kDa处出现明显蛋白表达条带，而未经IPTG诱导的则没有蛋白表达条带。

2.2D-氨基酰化酶的可溶性分析

将IPTG诱导后的重组菌破胞，离心后分别收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示。

M.蛋白质标记　1.上清液　2.沉淀

从图2可以看出，上清液中的蛋白含量比沉淀中的蛋白含量少，因此D-氨基酰化酶的可溶性不高。

2.3D-氨基酰化酶的Ni2+柱纯化

IPTG诱导表达的D-氨基酰化酶基因的pET22b载体上有His标签，可用Ni2+柱纯化。将1 L粗酶液经Ni2+柱纯化，再用不同浓度的咪唑溶液洗脱，结果发现，用100 mmol·L-1咪唑溶液洗脱可以得到较高纯度的目的蛋白，如图3所示。D-氨基酰化酶的纯化结果见表1。

M.蛋白质标记　1～2.PBS缓冲液洗脱液　3～4.50 mmol·L-1

表1

D-氨基酰化酶的纯化结果

Tab.1

Purification results of D-aminoacylase

从表1可知，1 L发酵液经Ni2+柱纯化后，可获得纯化目的蛋白15.81 mg，以N-乙酰-D-蛋氨酸为底物，在37 ℃测得的总活力为7 220.9 U，比活力为456.71 U·mg-1，是纯化前的12.4倍。

2.4重组菌发酵条件优化

2.4.1IPTG浓度对酶活力的影响(图4)

图4　IPTG浓度对酶活力的影响

由图4可以看出，0.1 mmol·L-1的IPTG诱导时菌体浓度和酶活力都较小；随着IPTG浓度的增大，菌体浓度和酶活力均逐渐增大；当IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时，菌体浓度和酶活力都达到最大；但由于IPTG本身对E.coli细胞具有毒性，随着IPTG浓度的进一步增大，菌体浓度和酶活力均减小。因此，最佳IPTG浓度为0.5 mmol·L-1。

2.4.2诱导时机对酶活力的影响(图5)

图5　诱导时机对酶活力的影响

由图5可以看出，当菌体浓度OD600值达到0.6时加入IPTG，此时表达的D-氨基酰化酶的酶活力最大，为90.1 U·mL-1；IPTG加入过早会使菌体生长不完全，蛋白表达不充分；IPTG加入过晚会使菌体过度生长，培养基养分不足以供应蛋白的表达。因此，最佳诱导时机为菌体浓度OD600值达到0.6时加入IPTG。

2.4.3诱导时间对酶活力的影响(图6)

图6　诱导时间对酶活力的影响

由图6可以看出，当IPTG诱导1～5 h时，菌体浓度和酶活力都逐渐增大；诱导5～24 h时，菌体浓度仍逐渐增大，酶活力却逐渐减小。这是由于，诱导时间延长，后期菌体大量死亡，导致酶活力减小；在IPTG诱导5 h时表达的D-氨基酰化酶的酶活力最大，为90.9 U·mL-1。因此，最佳诱导时间为5 h。

3结论

将粪产碱杆菌的D-氨基酰化酶基因插入到pET22b表达载体上，以E.coliBL21(DE3)为宿主菌，IPTG诱导表达D-氨基酰化酶。D-氨基酰化酶的可溶性不高，经Ni2+柱纯化后的比活力为456.71 U·mg-1，是粗酶的12.4倍。重组菌的最佳发酵条件为：37 ℃通气培养至菌体浓度OD600值为0.6时，加入0.5 mmol·L-1诱导剂IPTG诱导5 h，在此条件下，D-氨基酰化酶的酶活力为90.9 U·mL-1。该研究为今后D-氨基酰化酶的大规模工业化生产奠定了基础。

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Isolation,Purification and Fermentation Conditions Optimization ofAlcaligenesFaecalisD-Aminoacylase

TAO Jin,NI Meng-xiang

(SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract：Heat shock method was applied to transform recombinant plasmid containing Alcaligenes faecalis D-aminoacylase gene into Escherichia coli,and then the recombinants were screened.D-Aminoacylase from the engineering bacteria was isolated and purified by Ni-NTA affinity chromatography.The fermentation conditions of D-aminoacylase were optimized by a single factor experiment.The results showed that D-aminoacylase was purified up to 12.4 times with a recovery rate of 50%,and its specific activity was 456.71 U·mg-1.The optimum fermentation conditions were as follows:after aerobic cultured at 37 ℃ to OD600value of 0.6,induced 5 h with addition of 0.5 mmol·L-1IPTG.Under above conditions,D-aminoacylase activity was 90.9 U·mL-1.

Keywords：D-aminoacylase;Alcaligenes faecalis;isolation and purification;fermentation condition;optimization

中图分类号：TQ 920Q 55

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)04-0055-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.014

作者简介：陶金(1989-)，男，辽宁抚顺人，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学，E-mail：taojincpu@126.com；通讯作者：倪孟祥，副教授，E-mail：nimx_2000@aliyun.com。

收稿日期：2015-12-30