鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用

孙庆歌，刘丹，肖爱芳，李晶梅，祝春花，李 建，朱薇，廖园园，漆世华，谢红玲*

(1.武汉中博生物股份有限公司，湖北 武汉 430070；2.中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用

孙庆歌1，刘丹2，肖爱芳1，李晶梅1，祝春花1，李 建1，朱薇1，廖园园1，漆世华1，谢红玲1*

(1.武汉中博生物股份有限公司，湖北 武汉 430070；2.中国兽医药品监察所，北京 100081)

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗毒免疫SPF鸡，制备血清3型鸭甲型肝炎诊断用标准阳性血清，对制备血清进行无菌、支原体和特异性检验以及效价测定，并用该抗血清进行鸭病毒性肝炎治疗试验。结果表明，该血清无菌检验合格，无支原体污染，特异性良好，无禽类常见13种外源病毒抗体，血清中和效价为10-2.8。发病雏鸭紧急治疗保护率为91.67%,而与血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1）无交叉保护。

血清3型鸭甲型肝炎病毒；抗血清；治疗

鸭病毒性肝炎是危害雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病。本病传播迅速，病程短，死亡率可达90%以上，给养鸭业带来很大的经济损失[1]。鸭病毒性肝炎的致病原，目前已经研究的比较清楚，主要是由小RNA病毒科禽肝病毒属3种不同基因型鸭甲型肝炎病毒和星状病毒科禽星状病毒属的2种鸭星状病毒引起[2]。根据文献报道，我国国内主要流行病毒株为DHAV-1，但DHAV-3在我国部分地区的商品鸭群中呈流行趋势[3，4]。DHAV-1和DHAV-3不仅属于不同的基因型，而且也是不同的血清型，两种血清型无交叉反应[5，6]。但该两种血清病毒所引起的鸭病毒性肝炎病，在临床症状和病理变化上极为相似，不借助实验室检测手段进行鉴别诊断是十分困难的[7]。目前预防和控制鸭病毒性肝炎的主要手段是疫苗免疫接种和卵黄抗体治疗。但近年来，不断有免疫疫苗后仍然暴发鸭病毒性肝炎以及卵黄抗体无保护的临床报道，考虑可能与致病原发生变异或者血清型不符等原因有关。

本研究通过用DHAV-3 B54株疫苗毒免疫SPF鸡，制备一批DHAV-3标准抗血清，并对实验条件下发病雏鸭的治疗效果及与DHAV-1交叉保护情况进行观察。现报告如下：

1 材料

1.1 病毒 DHAV-3致弱疫苗毒 （B54株）、DHAV-1（ATCC株）、鸭瘟疫苗株病毒（DPV），由武汉中博生物股份有限公司保存。

1.2 抗体ELISA检测试剂盒 禽流感病毒(AIV)抗体、传染性支气管炎病毒(IBV)抗体、鸡新城疫病毒（NDV）抗体、传染性喉气管炎病毒（ILTV）抗体、禽传染性法氏囊病毒 (IBDV)抗体、鸡贫血病毒(CAV)抗体、禽白血病病毒(ALV)抗体、禽脑脊髓炎病毒（AEV）抗体、禽呼肠孤病毒（REO）、网状内皮组织增殖病毒(REV)抗体检测试验盒，均购自北京IEDXX公司。

1.3 检测用抗原和抗体 减蛋综合征病毒（EDS76）HA抗原，DHAV-1和DHAV-3鸭阳性血清及阴性血清均由武汉中博生物股份有限公司制备、鉴定和保存。

1.4 培养基 无菌检验培养基：硫乙醇酸盐培养基（T.G），酪胨琼脂培养基（G.A），葡萄糖蛋白栋培养基（G.P）；支原体培养基：改良 Frey氏固体和液体培养基，均购自北京海淀中海动物保健科技公司。

1.5 试验动物 SPF鸡3周龄，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸭种蛋购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；10日龄鸭胚和易感雏鸭，均购自武汉市畜牧兽医科学研究所；10日龄SPF鸡胚，用购自济南斯帕法斯家禽有限公司SPF种蛋进行自孵。

2 方法

2.1 抗血清的制备

2.1.1 免疫原的制备与纯化 将DHAV-3 B54株种毒1:1000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚，每胚0.1ml，置于37℃孵化箱继续孵化，不必翻蛋。收集36～96h死亡鸭胚，无菌收集尿囊液。纯化方法为： 将收获的尿囊液装入透析袋，用PEG20000进行包埋浓缩处理，待体积浓缩至原体积的1/50时，10000r/min离心60min，取上清液，再在同样条件下45000r/min离心150min，弃去上清，再加入等体积灭菌PBS，悬浮沉淀物，-20℃冻存备用[8]。

2.1.2 免疫及采血 将浓缩后的DHAV-3经肌肉注射途径接种3周龄SPF鸡10只，0.5ml/只，隔离器中饲养。14日后加强免疫一次，加强免疫后28日，经心脏无菌采血，分离血清[9]。

2.2 细菌与霉菌检测 按现行 《中国兽药典》附录第42页进行，将制备的混合血清分别接种T.G小管及G.A斜面各2支，每只0.2ml，分别各一支置 37℃和 25℃，另取 0.2ml接种 G.P小管，置25℃，均培养7d，观察有无细菌和霉菌生长。

2.3 支原体检验 按现行《中国兽药典》附录49页进行检测，将制备的混合血清取0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置37℃培养，同时设滑液支原体和灭菌生理盐水作阳性和阴性对照。分别于接种后 5、10、15日进行移植培养，观察14日。在上述每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.2ml接种于支原体琼脂平板固体培养基，置含5%～10%CO2潮湿的环境，37℃培养14日，观察结果。

2.4 特异性检测

2.4.1 中和试验 将制备血清于 56℃水浴灭活30min，分别与 DHAV-1、DHAV-3及 DPV (100ELD50)等量混合。37℃感作 1h，感作后的DHAV-1和DHAV-3分别经尿囊腔接种5枚10日龄鸭胚；感作后的DPV经绒毛尿囊膜接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，连续观察7日，记录胚死亡情况。

2.4.2 ELISA检测 应用 ELISA法检测 AIV抗体、NDV抗体、IBV抗体、ILTV抗体、IBDV抗体、CAV抗体、AEV抗体、REO抗体、REV抗体、ALV抗体。具体操作方法参见IDEXX产品说明书。

2.4.3 HI方法检测 应用HI方法检测所制备的抗血清中EDS76病毒抗体，具体操作方法参考现行《中国兽药典》附录第11页进行检测。

2.5 中和效价的测定 采用固定病毒-稀释血清法。将待检血清、阳性血清和阴性血清置于56℃水浴中灭活30min；用灭菌PBS进行2倍系列稀释。将3型鸭肝炎病毒（B54株）稀释至200ELD50/ 0.1ml，分别与等量的不同稀释度的待检血清、阳性血清和阴性血清相混合。37℃感作1h。将感作好的混合液，每个稀释度经尿囊腔接种SPF鸭胚5枚，每胚接种0.2ml，同时设置5枚鸭胚接种灭菌PBS作为空白对照，接种后封闭针孔，置37℃继续孵育，每天照蛋检查鸭胚情况，连续观察 7d，记录鸭胚死亡数量，按Reed-Muench法计算中和抗体效价。

2.6 治疗试验 选择 1日龄樱桃谷雏鸭 60只，平均分成2组，第1组为ATCC攻毒试验组，第2组为DHAV-3 G攻毒试验组。各试验组又平均分成攻毒对照小组和治疗小组，各小组15只雏鸭分别隔离饲养，于7日龄攻毒，攻毒剂量均为103.0LD50/0.5ml，当攻毒后各试验组雏鸭出现发病症状后，立即对各治疗小组雏鸭腿部肌肉注射0.5ml抗血清。连续观察7日，统计雏鸭死亡情况。

3 结果

3.1 细菌、霉菌与支原体检测 按照现行《中国兽药典》附录42页和49页进行无菌和支原体检验，结果表明所制备的血清无细菌、霉菌和支原体生长。

3.2 特异性

3.2.1 中和试验 抗血清与DHAV-3感作后，接种的5枚鸭胚，连续观察7日均未出现死亡，而鸭瘟病毒和1型鸭肝炎病毒抗血清感作组，两组接种的胚在120h内全部死亡。说明所制备的血清对DHAV-1和DPV无中和作用，是抗DHAV-3特异性血清。

3.2.2 ELISA检测 使用IDEXX ELISA抗体检测试剂盒，分别对 AIV、NDV、IBV、ILTV、IBDV、CAV、AEV、REO、REV、ALV抗体进行检测，检测结果均为阴性。

3.2.3 HI方法检测 使用HI方法检测抗血清中EDS76病毒抗体，检测结果也为阴性。

3.3 中和效价测定 结果阳性血清对照和空白对照鸭胚全部健活，而阴性血清对照全部死亡。阳性和阴性血清平行试验成立，按Reed-Muench法计算所制备的抗血清中和效价为 10-2.8，表明该血清在1:632稀释时可保护50%的接毒鸭胚免于死亡，见表1。

表1 中和试验结果

3.4 治疗试验 将隔离饲养的 7日龄雏鸭进行攻毒，24h前各小组均无发病死亡现象。在攻毒后26h，当DHAV-3 G株攻毒对照组第一例雏鸭出现发病症状时，对两治疗组鸭腿部肌肉注射0.5ml抗血清，观察7日，DHAV-1 ATCC株和DHAV-3 G株攻毒对照组分别出现86.7%和 80%的死亡率，表明攻毒对照成立。出现发病雏鸭后紧急注射抗血清，对DHAV-1 ATCC株和DHAV-3 G株攻毒保护率分别为15.38和91.67，见表2。

表2 攻毒后雏鸭死亡情况

4 讨论

本试验中使用的免疫原是经过纯化的尿囊液病毒，没有使用胚组织毒是因为其含有大量宿主杂蛋白，不仅会影响所制备的抗血清效价，而且还会影响在免疫酶技术中的使用效果。对于鸭肝炎病毒，虽然尿囊液中的病毒含量（滴度）较低，但是其它杂蛋白相对于胚组织量少，便于病毒抗原的纯化与浓缩。

关于抗血清治疗试验，抗血清的使用时机非常重要，一般在发病后24h内使用，效果比较明显。由于鸭肝炎发病急促，一旦出现发病症状后，几小时内就会死亡，对病死雏鸭进行解剖，可发现肝脏肿大、有明显的出血点或出血斑，脑部也出现水肿，故当观察到症状后再用血清治疗，很难奏效。我们根据多次两株强毒的攻毒试验研究，该毒株的攻毒剂量控制在一定范围内，一般均在攻毒24h后出现发病死亡，死亡高峰出现在32～48h。另外鸭肝炎病毒传染能力极强，同群感染率高，所以对抗血清治疗效果评价，以攻毒后抗血清的保护率为标准，即（对照组死亡率-治疗组死亡率）/对照组死亡率，为使试验结果更加确切，把抗血清使用时机定为攻毒后第一只雏鸭发病以后，以使抗血清治疗效果更加接近实际应用。

本试验表明，制备的DHAV-3血清对DHAV-1基本无保护作用，这与鸭胚血清中和试验具有一致性，故在临床生产中，对易感雏鸭无论是免疫还是抗血清治疗，要与流行发病的病株血清血清型一致才有保护效果。

[1] Anchun C,Mingshu W,Hongyi X,et al.Development and application of a reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect Chinese isolates of duck hepatitis virus type 1[J].J Microbiol Methods,2009,77(3):332-336.

[2] Fauquet C M,Mayo A,Maniloff J,ea al.Virus Taxonomy [M].Eighth Report of International Committee on Taxonomy ofViruses，Calif:Elsevier Academic Press,2005:757-778

[3] 刘建，苏敬良，张克新，等.新型鸭肝炎病毒流行病学调查及免疫防治试验[J].中国兽医杂志,2006,42 (2):3-6.

[4] 马秀丽，赵立娜，夏雪梅，等.一株韩国新型DHV的分离及RT-PCR鉴定[J].浙江农业学报,2010,22(5): 596-598.

[5] Wang L,Pan M,Fu Y,et al.Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J]. Virus Genes, 2008,37(1):52-59.

[6] Tseng C H,Tsai H J.Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J].Virus Res,2007,126(1-2):19-31.

[7] 苏敬良，黄 瑜，贺荣莲，等.新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定[J].中国兽医科技,2002,32(1):15-16.

[8] 胡燕宾.鸭肝炎病毒（DHV-1）的纯化及结构蛋白分析[D].重庆：西南大学,2007.

[9] 李俊平，杨承槐，李启红，等.鸡抗REV血清的制备与检定[J].中国兽药杂志,2011(09):15-18.□

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S858.324.4+3

B

1673-1085（2016）2-0012-04

2016-01-12

孙庆歌，硕士，从事禽病的分子诊断技术研究。

⋆通讯作者：谢红玲，E-mail：13419546263@163.com。