盆炎方对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织TNF-α、EGF蛋白表达的影响

戴　月，匡继林*

(1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005）



盆炎方对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织TNF-α、EGF蛋白表达的影响

戴月1，匡继林2*

(1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005）

〔摘要〕目的观察盆炎方对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、表皮生长因子（EGF）蛋白表达的影响。方法以“机械性损伤+混合菌种接种法”建立盆腔炎性疾病后遗症SD雌性大鼠子宫模型。造模成功后随机分为模型对照组、妇科千金胶囊组及盆炎方高、中、低剂量组，另设空白对照组和假手术组共计7组，每组8只。分别以盆炎方高、中、低剂量药液、妇科千金混悬液及同等体积蒸馏水灌胃21 d。采用免疫组化法检测各组大鼠子宫组织中TNF-α、EGF蛋白表达的差异。结果与模型组比较，盆炎方各剂量组大鼠子宫组织的TNF-α表达明显降低（P<0.05）；盆炎方中、高剂量组大鼠子宫组织的EGF蛋白表达明显升高（P<0.05）；结论盆炎方高剂量组能够显著降低盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫中TNF-α的表达，明显增强盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫中EGF的表达，盆炎方对盆腔炎性疾病后遗症有积极治疗作用。

〔关键词〕盆腔炎性疾病后遗症；盆炎方；肿瘤坏死因子-α；表皮生长因子；大血藤；败酱草

盆腔炎性疾病后遗症（sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID）是指女性上生殖道及盆腔周围结缔组织的一种慢性炎症[1]。是妇科的常见病、多发病。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作为一种促炎症因子和免疫调节因子，在炎症反应中发挥着重要作用。当机体遭遇急、慢性炎性反应或免疫反应时，它可根据程度不同而做出不同反应。罹患盆腔炎性疾病后遗症，多由于自身免疫力下降，对于外来疾病的防御力减弱，致使盆腔组织容易受到细菌、微生物等的混合感染，炎症细胞浸润子宫内膜组织、宫旁组织及盆腔结缔组织后产生炎性渗出、纤维化、粘连等一系列炎症表现。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）对上皮细胞具有修复作用[2]。在其作用之下，能够加速细胞增殖，使已经分化成熟的细胞不断生成新生细胞，从而替代衰老及凋亡细胞，起到修复与再生的作用。

盆炎方是湖南省中医院名老中医谢剑南教授在临床治疗SPID的经验效方,已临床效验多年，临床观察发现本方对湿热瘀结型SPID疗效显著[3]，但药理作用机制、作用原理尚未完全明确。本实验旨在通过采用“机械性损伤+混合菌种接种法”制备SPID大鼠子宫模型，并对盆炎方各剂量组干预治疗后的盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织中炎性因子TNF-α及EGF蛋白表达的差异性进行观察，从而探讨盆炎方治疗该病的作用机制。现将结果报道如下。

1材料

1.1实验动物

雌性、健康未孕的SD大鼠60只，体质量（205.72±16.36）g，鼠龄8～12周，购自湖南斯达克景实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.2实验药物及菌种

干预用中药：盆炎方，由湖南中医药大学第二附属医院制剂室提供。药物组成：大血藤20 g,败酱草15 g,虎杖15 g,续断15 g,杜仲15 g,当归10 g,赤芍10 g,丹参10 g,泽兰10 g,香附10 g,牡丹皮10 g,生蒲黄10 g,三七粉6 g,乳香5 g,没药5 g,甘草5 g。阳性对照药：妇科千金胶囊，由株洲千金药业股份有限公司生产。0.4 g/粒。金黄色葡萄球菌（ATCC131101）、大肠杆菌（ATCC131102）、乙型溶血性链球菌（ATCC131103）按照为1∶1∶2配成30×108/mL浓度的混合细菌悬液。实验菌种由湖南中医药大学微生物教研室提供。

1.3试剂

TNF-α检测试剂盒、EGF检测试剂盒（均购自武汉博士德生物工程有限公司）。

2方法

2.1模型建立

在以往细菌感染致炎的基础上，加用机械性损伤子宫内膜的因素来制备SPID大鼠子宫模型[4-5]。使用2％戊巴比妥钠进行腹腔注射以麻醉大鼠(40 mg/kg)，待麻醉生效后，用橡皮筋牵拉大鼠四肢并固定于实验解剖盘上，剪去下腹部被毛。在相对无菌条件下，取大鼠下腹正中切口约0.8～1 cm，开腹后暴露Y型子宫。在注入菌液之前用无菌注射器机械损伤子宫内膜（注射器磨去针尖并轻柔来回搔刮左侧子宫），然后用1 mL注射器抽取0.2 mL混合细菌悬液[6](金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌以1∶1∶2的比例溶于无菌生理盐水配成30×108/mL浓度的混合细菌悬液)，向大鼠左侧输卵管-卵巢方向缓慢推注，注毕，用眼科镊夹闭针孔，防止菌液溢出。分层关腹，用2％碘酊消毒术区。假手术组将大鼠麻醉后，依据上述步骤开腹，不做任何损伤性操作，直接分层缝合术野；空白组不造模。

2.2分组

将60只SD雌性大鼠随机分为空白组8只、假手术组8只、模型对照组44只。观察性喂养第15天，随机抽取模型对照组大鼠4只行造模评价，待造模评价提示造模成功后，再随机将模型对照组大鼠分成：盆炎方高剂量组、中剂量组、低剂量组、妇科千金胶囊组、模型对照组，每组各8只。

2.3给药

盆炎方每剂含生药171 g，妇科千金胶囊每日服用剂量2.4 g。按成人平均体质量为60 Kg计算，根据“人和动物间体表面积折算给药剂量比率表[7]”折算成成人等效剂量的0.5、1、2倍，分别为盆炎方高剂量组3.56 g/Kg、中剂量组1.78 g/Kg、低剂量组0.89 g/Kg、妇科千金胶囊组0.22 g/Kg灌胃给药；上述各组给药体积均为1 mL/100 g。空白组、假手术组、模型对照组分别给予以等容量蒸馏水灌胃，给药体积均为1 mL/100 g。每日1次（上午8：00-9：30），连续给药21 d。每周称质量1次，根据大鼠体质量变化予以调整相应给药量。

2.4取材方法

相对无菌条件下取出完整的大鼠子宫，用10％福尔马林溶液浸泡固定标本，经脱水透明，石蜡包埋，石蜡切片机连续切片制成厚约5 μm的石蜡切片，分别进行HE染色和免疫组化检测。

2.5免疫组化法

依据试剂盒操作说明进行以下操作：将载玻片用APES防脱片剂处理，捞片后置烤箱58～60℃30～60 min以使切片紧密黏附；切片常规脱蜡至水化；3％H2O2去离子水（无色液体），室温孵育5～10 min以消灭内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，3 min×3次；滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10～15 min，倾去，勿洗；按比例稀释的一抗，37℃孵育2～3 h或4℃过夜；PBS冲洗，3 min×3次；滴加试剂B（黄色液体），室温或37℃孵育5～10 min；PBS冲洗，3 min×3次；滴加试剂C（橙色液体），室温或37℃孵育10～15 min；PBS冲洗，3 min×3次；显色剂显色（DAB或AEC）；自来水充分冲洗。封片。

2.6结果判定

上述染色均设阳性对照片和阴性对照片，阳性对照片为已知切片，阴性对照片为PBS替代一抗，显微镜观察，阳性结果为：胞浆、胞核、胞膜为棕黄色颗粒。镜下组织细胞结构清楚，阳性颗粒定位好，染色高于背景。免疫组化阴性无染色。采用Motic B5显微摄像系统拍照，400倍视野下每个切片随机摄取4个视野，用医学图像分析系统分析每个阳性细胞的平均灰度值，信号强度用平均灰度值表示，平均灰度值越大，说明表达越强。

2.7统计方法

实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计处理，数据处理与统计分析计量资料以“±s”进行表示。先检验样本验方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，可采用One-Way ANOVA检验，并进行组间的多重比较；如果不符合正态性和方差齐性时，可采用Dunnett t检验进行组间比较。P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示有显著统计学意义。

3结果

3.1模型成功判定标准[8-9]

肉眼观察：子宫形态异常（迂曲或扩张）、子宫充血、肿胀、积液、积脓或与盆腔周围组织发生粘连；盆腔积液。病理学观察：宫腔积液、扩张或粘连、腔壁结构紊乱、固有层变薄或消失、上皮细胞脱落或坏死、内膜水肿或充血、炎性细胞浸润、脱落等。见图1。

图1　SPID模型病理显微光镜图（HE染色×400）

3.2各组间大鼠子宫组织中TNF-α蛋白表达

与空白组、假手术组比较，所有致病大鼠子宫组织中TNF-α表达均增加，以模型对照组最高，差异具有统计学意义（P<0.05），提示模型造模成功；与模型对照组比较，盆炎方低、中、高剂量组及妇科千金胶囊组子宫组织的TNF-α表达明显下降（P<0.05）；与妇科千金胶囊组比较，盆炎方低、中剂量组的TNF-α蛋白表达有统计学意义（P<0.05）；盆炎方高剂量组与妇科千金胶囊组比较无统计学意义（P> 0.05）。通过盆炎方低、中、高剂量组及妇科千金胶囊干预治疗后的盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织中TNF-α蛋白表达具有明显的调节作用。结果见表1，图2。

图2　各组免疫组化TNF-α光镜图（×400）

3.3各组间大鼠子宫组织中EGF蛋白表达

与空白组、假手术组比较，所有致病大鼠子宫组织中EGF表达均下降，以模型对照组最低，差异具有统计学意义（P<0.05），提示模型造模成功；与模型对照组比较，盆炎方中、高剂量组子宫组织的EGF蛋白表达明显升高（P<0.05）；与妇科千金胶囊组比较，盆炎方低、中、高剂量组子宫组织的EGF蛋白表达无显著性差异（P=0.410>0.05）。结果见表1，图3。

表1　各组SPID大鼠子宫中TNF-α、EGF蛋白表达（灰度值，±s，n=8）

表1　各组SPID大鼠子宫中TNF-α、EGF蛋白表达（灰度值，±s，n=8）

注：与空白组、假手术组比较，△P<0.05；与模型对照组比较，▲P<0.05。

组别空白组假手术组模型对照组妇科千金组盆炎方低剂量组盆炎方中剂量组盆炎方高剂量组F值给药剂量（g/Kg）---2.2 8.9 17.8 35.6 TNF-α 129.2±17.9 132.6±19.8 192.9±15.5△142.8±9.7△▲171.9±16.3▲* 155.3±11.6▲* 147.8±29.8△▲30.174 EGF 207.0±10.7 192.4±9.9 149.2±31.4△176.4±11.5△▲151.6±17.9▲166.3±9.2▲178.9±16.0△▲21.334

图3　各组免疫组化EGF光镜图（×400）

4讨论

祖国医学对盆腔炎性疾病后遗症的认识尚未形成完善的理论体系，但在千年以前就有“妇人腹痛”、“热入血室”、“癥瘕”、“带下病”等病名，且这些病名所特有的临床表现多归属于SPID的范畴。中医学认为本病主要机制为冲任阻滞，胞脉失畅；或冲任虚损，胞脉失养。“盆炎方”原方为名老中医谢剑南教授治疗盆腔炎性疾病后遗症的经验效方。导师匡继林教授在沿袭传统的基础上，不断加以总结及化裁，方得今日之“盆炎方”。全方重在清利湿热、活血化瘀，临床对湿热瘀结型盆腔炎性疾病后遗症收效显著。本方以清利湿热、活血祛瘀之红藤、败酱草为君，当归补血活血、调经止痛，赤芍活血化瘀，丹参祛瘀止痛，三七化瘀止血、活血定痛，虎杖清热解毒，牡丹皮清热凉血祛瘀。六药为臣，配合君药清利湿热，并活血化瘀。乳香、没药为佐助药，二者相须为用，治疗瘀血阻滞所致诸痛症，增强臣药之行气活血之效。生蒲黄重在化血瘀配合泽兰通利小便，使湿从下而行，香附舒肝理气止痛。甘草为使，调和诸药。以上诸药合用，使得湿去热清，瘀除络通。更体现祛瘀不伤正、扶正不留邪的组方理念。

TNF-α主要有辅助T1细胞分泌[10]。它可能直接刺激中性细胞脱颗粒和“呼吸链”产生大量过氧化氢等自由基，导致炎症局部的组织损伤。它可通过激活细胞因子网络系统而诱发全身炎性反应[11]。TNF-α在空白组大鼠子宫组织中仅有少量表达，而在模型对照组大鼠子宫中的表达显著升高。经盆炎方干预治疗后，大鼠子宫组织中TNF-α表达较前降低，其中以盆炎方高剂量组尤为明显,且TNF-α的表达水平差异与盆炎方的剂量呈现出正相关趋势。由此可见，炎性介质可以上调TNF-α的表达，而通过盆炎方高剂量组治疗可有效降低TNF-α表达，从而起到降低炎症反应发生的作用。妇科千金胶囊是临床治疗盆腔炎性疾病后遗症的经典常用中成药，对于湿热瘀结型疗效显著，故选为本研究阳性对照药，妇科千金胶囊与盆炎方高剂量组均可显著降低模型大鼠子宫组织中TNF-α表达量，两者表达差异无统计学意义，故提示二者有类似的药理学效应。EGF本身是一种强而有力的细胞分裂促进因子，能够刺激机体内多种类型组织细胞的分裂及增生，具有十分广泛的生物学效应[12]。EGF表达增强可以促进上皮增殖、维护组织修复和细胞保护的作用。通过以上实验数据观察显示，盆腔炎性疾病后遗症模型大鼠子宫组织中EGF蛋白表达在造模后明显降低，在使用盆炎方药物干预后表达显著升高。考虑盆腔炎性疾病后遗症大鼠模型的盆腔炎症的程度与EGF表达水平密切相关。若能在疾病发生早期纠正EGF表达可能会是减轻盆腔粘连，预防和降低盆腔炎性疾病后遗症发生率的重要环节之一，从而达到治疗目的，而采用盆炎方治疗是可靠的治疗用药之一。综上所述，“盆炎方”活血化瘀、清热利湿效果明显。该方作用机制可能与减轻炎性反应、增强组织修复相关，这可能是盆炎方发挥抗炎作用的有效机制之一。

参考文献：

[1]曹泽毅.中华妇产科学[M].北京:人民卫生出版社,2000：212.

[2]聂昭华,郑文尧,郭荣斌.根除幽门螺旋杆菌前后消化性溃疡患者胃窦黏膜组织学及胃泌素、生长抑素、EGF等相关变化初探[J].中华消化杂志,2006,16(5):294-295.

[3]匡继林,席雅芳,贺冰,等.盆炎方治疗慢性盆腔炎（湿热瘀结型）30例临床观察[J].新中医,2008,4(40):57-58.

[4]徐向曦,陈明,龙子江,等.盆炎宁颗粒对细菌感染性慢性盆腔炎模型大鼠血液流变性改善作用的研究[J].中医药临床杂志, 2011,23(4):299-301.

[5]谢萍,冯俭,杨张婧,等.清湿止痛汤对慢性盆腔炎大鼠血清IL-2 和MDA水平影响的实验研究[J].河南中医,2011,31(6):607-608.

[6]赵琳,宋殿荣.盆腔炎性疾病实验模型的研究进展[J].医学综述, 2013,5(19):1 787-1 790.

[7] Jun CD, Shimaoka M, Carman CV, et al. Dimerization and the efec. tiveness of ICAM-1 in mediating LFA-1-dependent adhesion[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:6 830-6 835.

[8]师振予,郭建生,岳增辉，等.妇科千金片对急性盆腔炎模型大鼠外周血细胞及盆腔组织病理改变的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2011,17(21):199-200.

[9]李俊良,王建六,王世君，等.康妇炎胶囊对兔盆腔炎性疾病后遗症模型治疗的初步探讨[J].中国妇产科临床杂志,2010,11(6):443-446.

[10] Herbein G, O’brien WA. Tumor necrosis factor（TNF）-alpha and TNF receptors in viral pathogenesis [J]. Proc Soc Exp Biol Med,2000,223(3):241-257.

[11]刘丽,王亚男,王秀芬,等.中药冲剂对输卵管炎性阻塞性不孕大鼠血清TNF-α含量的影响[J].中国中医药科技,2008,15(1):21.

[12]唐雪莲,谢梅青,郑峥,等.表皮生长因子对人子宫内膜细胞GJIC影响的体外研究[J].中山大学学报(医学科学版),2006,27 (4):36-38.

（本文编辑杨瑛）

·基础研究·

The Influence of Penyan Decoction on the TNF-α and EGF Expression of Uterus in Rats with Pelvic Inflammatory Disease Sequelae

DAI Yue1，KUANG Jilin2*
（1. Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410005, China）

Abstract〔〕Objective To observe the influence of Penyan decoction (PYD) on the TNF-α and EGF expression of uterus in rats with pelvic inflammatory disease sequelae. Methods The uterus model rats with pelvic inflammatory disease sequelae were established by using "the mechanic injury and mixed bacteria inoculation" method. The successful model rats were randomly divided into model group, Fuke Qianjin capsule group, and high, medium and low dose of PYD groups and PYD low dose group, rats were also assigned into sham-operation group and normal control group, 8 rats in each group. The rats were intragastric administration with high, medium, low dose PYD liquid, Fufang Qianjin capsule and the same volume of distilled water for 21 days, respectively. The TNF-α and EGF expression of rats in all groups were detected by using the immunohisto chemical method. Results Compared with the model group, the expression of TNF-α was significantly decreased in the rats with different dose groups (P<0.05); the expression of EGF in medium dose group and high dose group was significantly higher (P<0.05). Conclusion PYF group with high dose could significantly reduce the expression of TNF-α and increase the expression of EGF in uterus of rats with pelvic inflammatory disease sequelae，and the PYD show positive treatment effect on sequelae of pelvic inflammatory disease.

Keywords〔〕sequelae of pelvic inflammatory disease；Penyan Decoction；TNF-α；EGF；Sargentodoxa cuneata；Dahurian patrinia herb

〔通讯作者〕*匡继林，女，主任医师，教授，硕士研究生导师，E-mail：kuangjlabc@tom.com。

〔作者简介〕戴月，女，硕士研究生，研究方向：中医药防治不孕不育症的研究。

〔基金项目〕谢剑南名老中医传承工作室资助项目。

〔收稿日期〕2015-10-03

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.004