热应激及热应激预处理对小鼠学习记忆以及情绪的影响

万娜，成亚纯，肖娟娟

·基础研究·

热应激及热应激预处理对小鼠学习记忆以及情绪的影响

万娜1，成亚纯1，肖娟娟2

目的：从行为学角度研究热应激（HS）及热应激预处理（HP）对小鼠学习记忆及情绪的影响。方法：雄性昆明小鼠32只随机分为对照组、HP组、HS组、（HP+HS）组4组各8只。通过Morris水迷宫评价小鼠学习记忆能力，开场试验评价小鼠自主活动，采用中国地鼠情绪唤醒水平评定量表测定情绪唤醒水平。结果：Morris水迷宫结果显示，与对照组相比，HS组寻找平台潜伏期延长，HP组寻找平台潜伏期缩短，（HP+HS）组寻找平台潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05）；（HP+HS）组与HS组相比，水平运动、垂直运动均有所增多（P＜0.05）;空间搜索试验中，与对照组比较，HS组在目标象限停留的时间明显延长，在目标象限对侧的第三象限停留时间缩短（P＜0.05）；开场试验中，与对照组相比，HS组水平运动、垂直运动、粪便粒数均减少（P＜0.05），中央格时间延长（P＜0.05）。结论：HP可使学习记忆能力加强，而急性HS则对学习记忆能力有损害作用，HP可对此损害产生一定保护作用，HS对学习记忆能力的影响随应激后时间推移有减弱趋势。HP使小鼠自主活动增强，急性HS可使自主活动降低。急性HS造成情绪唤醒降低，HP不改变情绪唤醒水平；HS及HP均可降低小鼠的体重。

热应激；热应激预处理；学习记忆；开场行为；情绪唤醒

热应激（heat stress，HS）是指人或动物暴露在高温环境中时，所产生的机体可以感知的一系列不适及生理上的疲劳状态等非特异性全身反应的总和[1,2]。环境温度的升高是一种物理信号的应激，其对机体的影响首先表现在神经内分泌系统，细胞外递质/激素浓度和其细胞膜上相应受体的结合容量发生变化，这些改变作用于信号转导系统，并最终引起体温调节平衡效应。研究证实，适当程度和强度的热应激即热应激预处理（heat stress preconditioning，HP）可增强机体对抗外界有害应激的能力，如可提高机体耐受高温、缺血的阈值等。本实验观察HP及HS后小鼠的行为学变化，研究HP及HS对小鼠学习记忆功能及情绪的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性昆明小鼠32只，6周龄，体质量（20～25）g，购自上海大学实验动物中心。饲养条件：（22±1）℃，相对湿度40%～50%，自然昼夜，非直接光照，自由摄食及饮水。

1.1.2 主要实验材料 Morris水迷宫（购于北京中国医学科学院药物研究所）；自制简易热应激仓；自制敞箱装置：敞箱由不透明材料制成，为50 cm× 50 cm×50 cm立方体，白线等分为25个等边方格；敞箱底面及周壁为黑色。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 采用随机数字表将所有小鼠随机分为4组，各8只：对照组、急性热应激（HS）组、热应激预处理（HP）组、热应激预处理后急性热应激（HP+HS）组。

1.2.2 HS动物模型建立 HP操作方法：动物在常温（22±1）℃下适应性饲养7 d。实验当天将实验小鼠与鼠笼一起放入带鼓风装置的烤箱内进行HS，温度（42±0.5）℃，时间为120 min。结束后测小鼠肛温为42℃，则HS模型建立成功。（HP+HS）组的小鼠在HP后的24 h与HS组小鼠同时进行HS。HP组在HP后不给予急性HS处理；对照组小鼠不作HS处理，于常温下饲养并置于未加热的烤箱内相同时间[3]。

1.2.3 行为学检测 急性HS结束后，将小鼠取出至常温下，对4组小鼠进行开场行为测试，记录各组小鼠在敞箱中的水平格数、垂直次数、修饰次数、中央时间及粪便颗粒数。于急性HS后当天恢复至常温时及第2天行Morris水迷宫测试，记录各组小鼠寻找平台的潜伏期，评价小鼠学习能力；记录各组小鼠在各象限停留的时间，评价小鼠的空间搜索能力。于每次水迷宫测试前，采用中国地鼠情绪唤醒水平评定量表测定情绪唤醒水平。行为评定需每次由3个人同时观察，在单盲条件下进行记录。

1.2.4 小鼠体质量监测 于HP前和HS后0、12、24、30、36 h测量各组小鼠体质量，体质量差/g=（实验前体质量-实验后体质量）/g。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HS对小鼠开场行为的影响

与对照组相比，HS组小鼠水平运动、垂直运动、粪便粒数明显减少，中央格时间延长（P＜0.05），但修饰次数无明显的变化（P＞0.05）；HP组小鼠的水平运动、垂直运动、修饰次数增多，中央格停留时间减少（P＜0.05），粪便粒数无明显变化（P＞0.05）；（HP+HS）组修饰次数减少、中央格停留时间增加（P＜0.05），其他参数变化无统计学意义（P＞0.05）。与HS组相比，HP组水平运动、垂直运动、修饰次数、粪便粒数增加（P＜0.05），中央格停留时间减少（P＜0.05）；（HP+HS）组水平运动、垂直运动、粪便粒数增多（P＜0.05），修饰次数及中央格停留时间无明显变化（P＞0.05），见表1。

表1 小鼠开场行为变化（）

表1 小鼠开场行为变化（）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与HS组比较，②P＜0.05

组别对照组H S组H P组（H P + H S）组只数8 8 8 8水平格数/格1 3 0 . 8 8 ± 6 . 1 0 1 0 8 . 0 0 ± 4 . 9 9①1 4 7 . 1 3 ± 4 . 4 2①②1 2 7 . 3 7 ± 2 . 1 3②垂直次数/次3 1 . 5 0 ± 1 . 7 7 2 2 . 1 3 ± 2 . 0 3①3 8 . 1 3 ± 2 . 0 3①②2 9 . 3 8 ± 2 . 4 5②组别对照组H S组H P组（H P + H S）组修饰次数/次1 2 . 5 0 ± 1 . 1 9 1 0 . 2 5 ± 1 . 1 6 1 5 . 5 0 ± 1 . 6 0①②1 0 . 6 3 ± 1 . 6 8①中央时间/ s 4 . 6 2 ± 1 . 0 6 1 3 . 6 2 ± 1 . 6 9①3 . 2 5 ± 0 . 7 1①②1 2 . 3 8 ± 1 . 6 9①粪便颗数/粒3 . 5 0 ± 0 . 5 3 1 . 3 7 ± 0 . 5 2①2 . 8 8 ± 0 . 8 3②3 . 2 5 ± 0 . 4 6②

2.2 HS对小鼠空间学习记忆能力的影响

2.2.1HS对小鼠定位航行学习能力的影响 在定位航行学习中，时间因素具有统计学意义（P＜0.01），说明各组小鼠的逃避潜伏期都有随时间变化而缩短的趋势。与对照组比较，在第1天的第一次、第二次定位航行试验中，HS组小鼠逃避潜伏期延长，HP组和（HP+HS）组小鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.05）；与HS组比较，HP组和（HP+HS）组小鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.05）。与对照组相比，在第2天的第三次、第四次定位航行试验中，HS组逃避台潜伏期延长（P＜0.05）；与HS组比较，HP组和（HP+ HS）组小鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.05），见表2。

表2 HS后各组小鼠逃避潜伏期比较（s，）

表2 HS后各组小鼠逃避潜伏期比较（s，）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与HS组比较，②P＜0.05

组别 只数 第一次航行试验 第二次航行试验对照组H S组H P组（H P + H S）组8 8 8 8 7 5 . 3 7 ± 5 . 1 8 9 3 . 5 0 ± 2 . 2 0①6 3 . 2 5 ± 2 . 3 7①②6 0 . 2 5 ± 2 . 3 7①②6 3 . 2 5 ± 4 . 6 8 7 8 . 3 8 ± 2 . 6 7①4 9 . 5 0 ± 2 . 4 5①②4 7 . 7 5 ± 2 . 5 5①②组别对照组H S组H P组（H P + H S）组第三次航行试验4 2 . 8 8 ± 5 . 6 4 6 4 . 3 8 ± 1 . 6 9①4 3 . 6 2 ± 2 . 3 8②4 1 . 1 3 ± 1 . 4 5②第四次航行试验3 6 . 6 3 ± 2 . 5 6 4 5 . 3 8 ± 1 . 6 9①3 1 . 8 7 ± 2 . 3 6②3 7 . 7 5 ± 2 . 7 1②

2.2.2 HS对小鼠空间搜索能力的影响 各组小鼠均在目标象限（第1象限）停留的时间最长；其中对照组小鼠在第1象限停留时间与在第2、3、4象限停留时间差异具有统计学意义（P＜0.05）；而HS组小鼠在第1象限停留时间与其它3个象限停留时间差异均存在统计学意义（P＜0.05）。与对照组小鼠比较，HS组小鼠在第1象限停留的时间明显延长（P＜0.05），而在第1象限对侧的第3象限停留时间则有所缩短（P＜0.05）；其它各组与对照组比较无统计学差异，见表3。

表3 HS后各组小鼠在各象限的停留时间比较（s，）

表3 HS后各组小鼠在各象限的停留时间比较（s，）

注：与第1象限停留时间比较，①P＜0.05；与对照组比较，②P＜0.05

组别对照组HS组HP组（HP+HS）组只数8 8 8 8第1象限35.37±1.30 41.25±1.28②33.50±1.51 32.63±1.69第2象限26.50±1.19①26.87±1.81①28.91±1.23 28.01±1.35组别对照组HS组HP组（HP+HS）组第3象限29.37±1.18①28.00±0.93①②28.13±1.64 27.25±1.83第4象限26.38±1.69①24.38±1.41①26.75±1.98 27.63±1.68

2.3 实验前后体质量比较情况

与对照组比较，（HP+HS）组小鼠0、12、24、30 h体质量均减轻（P＜0.05），HS组24、30、36 h体质量减轻（P＜0.05），HP组0、12、24 h体质量减轻（P＜0.05）；0、12、24、30、36 h（即给予急性HS后0、6、12 h）（HP+HS）组的体质量减轻大于HS组（P＜0.05）；HP组所有时间点的体质量变化明显大于HS组（P＜0.05），见表4。

表4 小鼠实验前后的体质量差比较（g，）

表4 小鼠实验前后的体质量差比较（g，）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与HS组比较，②P＜0.05

组别 只数0 h 1 2 h对照组H S组H P组（H P + H S）组8 8 8 8 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 1 . 0 1 ± 0 . 3 4①②1 . 2 5 ± 0 . 4 8①②-0 . 5 0 ± 0 . 1 7 -0 . 4 8 ± 0 . 9 6 2 . 8 9 ± 0 . 3 6①②3 . 6 5 ± 0 . 5 6①②组别对照组H S组H P组（H P + H S）组2 4 h -0 . 7 1 ± 0 . 2 0 0 . 2 6 ± 0 . 7 4①1 . 0 7 ± 0 . 4 7①②1 . 3 5 ± 0 . 4 0①②3 0 h -1 . 1 0 ± 0 . 4 4 2 . 0 9 ± 0 . 3 4①-1 . 0 7 ± 0 . 3 6②1 . 4 9 ± 0 . 6 7①②3 6 h -1 . 7 6 ± 0 . 7 1 1 . 6 9 ± 0 . 5 4①-1 . 6 1 ± 0 . 5 7②-0 . 3 5 ± 0 . 4 5②

2.4 情绪唤醒水平的评定

4次测定中各组得分均有逐渐下降的趋势，与对照组比较，HS组和（HP+HS）组的得分均降低（P＜0.05）；与HS组比较，HP组第1、3次得分均增加（P＜0.05），见表5。

3 讨论

HP是指经过一定时长和强度的热预处理后的组织对随之而后遭遇的损伤耐受阈值有所提高的现象[4-6]。研究认为通过HP可以提高机体在细胞及器官水平对外界有害应激的耐受能力[6-10]。国际公认的HP标准为升高动物肛温至42℃，并维持此温度25 min[11]。本实验成功建立HS模型和HP模型，与HS组和对照组比较。HP对机体虽然会造成一定程度可逆转的损伤如体质量减轻，但对HS产生的学习记忆能力损伤有一定的保护作用，同时还可缓解HS造成的自主活动减少。有报道，HP的热保护作用在分子水平表现为，可有效抑制HS后早期大脑皮质及海马CA1区神经元内一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性及表达的升高，同时它还可使皮质和海马CA1区神经元中NOS水平恢复致正常的过程加快[12]。

表5 小鼠情绪唤醒水平得分（分，）

表5 小鼠情绪唤醒水平得分（分，）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与HS组比较，②P＜0.05

组别对照组HS组HP组（HP+HS）组只数8 8 8 8第1次5.25±1.28 2.25±0.71①4.75±0.71②2.75±0.71①第2次3.00±0.76 1.88±0.99①2.38±0.74 1.50±1.20①组别对照组HS组HP组（HP+HS）组第3次2.50±0.93 1.38±0.74①2.13±0.83②0.88±0.83①第4次2.33±0.87 1.12±0.66①2.01±0.76 0.81±0.54①

与对照组相比，HS组、HP组、（HS+HP）组小鼠的体质量均有明显的下降（P＜0.05）；与HS组相比较，（HP+HS）组小鼠的体质量在0、12、24、30、36 h均明显高于HS组(P＜0.05)。本研究结果显示，HS及HP均能显著降低小鼠的体质量，且与（HS+HP）小鼠相比，单纯给予HS干预的小鼠的体质量下降的程度更大。

Morris水迷宫结果显示，与对照组相比，单纯HP可使学习记忆能力加强，而急性HS处理则对学习记忆能力有损害作用，HP可对此损害产生一定保护作用，但HS对学习记忆能力的影响随应激后时间推移有减弱趋势。有研究认为，在高温下中枢神经系统生长因子表达增加，使神经细胞热损伤得到有效保护。在脑缺血后6 h，脑源性神经生长因子（brain derived neurophic factor，BDNF）的表达开始增高，表达高峰为第3天[13,14]。同时，本实验结果显示，HP后给予HS的小鼠在1 d的试验中，潜伏期较对照组明显缩短，表明HP后给予HS仍然对小鼠学习记忆的能力有一定增强作用，且其效益高于单纯给予HP组，目前其具体的机制仍有待进一步研究澄清。

开场实验结果显示，与对照组相比，HS可造成情绪唤醒水平降低，而单纯HP并未造成明显情绪唤醒影响，HP对缓解HS引起的情绪唤醒降低无明显作用。在高温环境时，中枢神经系统可出现先兴奋后抑制的现象。高温下大脑皮质调节的中枢兴奋性增加，而负诱导使得中枢神经系统运动功能受到抑制，神经内分泌系统反应得到加强，导致血液中的抗利尿激素、肾素-血管紧张素II、醛固酮的浓度增加，使机体产热量以及耗氧量升高，使得活动度增强。因此各组情绪唤醒和自主活动水平的差异，可能与HS时间与方式有一定关系。

综上所述，HP可使学习记忆能力加强，而急性HS则对学习记忆能力有损害作用，HP可对此损害产生一定保护作用，HS对学习记忆能力的影响随应激后时间推移有减弱趋势。HP使小鼠自主活动增强，急性HS可使自主活动降低，HP可减少此影响。急性HS造成情绪唤醒降低，HP不能其影响作用；HP不改变情绪唤醒水平；HS及HP均可降低小鼠的体重，且单纯给予HS干预的小鼠的体质量下降的程度更大。

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（本文编辑：唐颖馨）

R741;R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.019

1.湖北省应城市人民医院湖北 应城 432400

2.湖北科技学院基础医学院湖北 咸宁 430073

湖北科技学院校级青年课题（No.KY11070）

2015-11-15

肖娟娟xjjuan2006@126.com