酸奶中乳酸菌计数方法的探讨

陈晓燕

摘 要：目的是通过方法的选择对乳酸菌计数方法进行优化。方法：采用涂布法和倾注法分别对6种市售的酸奶制品进行检测，并分别用生理盐水、PBS缓冲液、CYS缓冲液进行乳酸菌计数结果比较。结果：6种酸奶制品分别用倾注法和涂布法所得的乳酸菌数结果从统计学意义上均无差别；6份样品在三种不同稀释液的计数结果里CYS缓冲液为最优稀释液。结论：倾注法和涂布法对乳酸菌计数无影响，若仅对样品中乳酸菌做计数要求，则可选择采用倾注法进行检测，选择CYS缓冲液进行乳酸菌计数明显优于国标方法，可以用于食品中乳酸菌计数。

关键词：大豆蛋白酶解产物 生物活性肽 轻度酶解 苦味肽 功能特性

近年来，由于人们生活水平和健康意识的提高，酸奶已成为一种深受广大消费者喜爱的乳制品之一，但其在生产制作或运输过程中如储存不当，会使当中乳酸菌的数量减少，而酸奶营养价值主要来源于其中乳酸菌的数量多少，故酸奶中活性乳酸菌的数量减少直接影响酸奶的质量[1]。确计数活性乳酸菌制品中的乳酸菌，卫生部于2010年发布了修订版《食品微生物检验 乳酸菌检验》GB 4789.35-2010[2]，与2008版相比修订版中修改了乳酸菌总数、乳杆、双岐杆菌、嗜热链球菌的计数方法。但该标准中仅规定了一种平板涂布法作为检测样品中乳酸菌数量的方法，且要求操作者从样品稀释到平板涂布在15分钟内必须完成。笔者以多年从事乳酸菌数量检测工作经验认为，对于少量样品的检测，按照国标来操作是完全可以实现的，但在实际工作中，往往由于种种原因的限制，对于大样本大样本量（n>20），仍采用国际来进行检测，具有非常大的实际困难。因此，本文从市面上随机选取6种品牌的酸奶，通过比较平板涂布法与倾注培养法之间的差异，以及不同稀释液结果比较，以保证真实反映酸奶中乳酸菌数量可供进一步修改国标的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 随机选择6份不同商品名的含活性乳酸菌含量较高、均匀性较好的酸奶制品。

1.1.2 稀释液：（1）生理盐水、（2）PBS缓冲液、（3）CYS缓冲液（L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液：L-半胱氨酸盐酸盐0.20g，磷酸氢二钠2.40g，磷酸二氢钾1.80g，吐温800.24g，于400mL纯化水中，搅拌使其充分溶解；以NaOH溶液调pH为6.8～7.0，灭菌条件121℃、15min）。

1.2方法

1.2.1 平板法：将上述样品根据待检样品活菌数估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形玻璃棒进行表面均匀涂布，每个稀释度更换一个L形玻璃棒。同时做空白对照。

1.2.2 倾注法：将上述样品根据待检样品活菌数估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液分别置于2个空培养皿中，倾入50℃左右的MRS琼脂约20mL，轻轻振摇混匀，待凝固后翻转平皿。

1.2.3 统计分析：采用 SPSS11.5统计软件，用数据表示，采用“两独立样本t检验”以P<0.05表示统计学差异。

2 结果：

2.1涂布法和倾注法对乳酸菌计数结果的影响

样品稀释过程按照GB 4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验操作，分别进行平板涂布和常规倾注进行培养。分别采用涂布法和倾注法，以稀释时间为立即，对六份样品中乳酸菌总数检测结果见表1。

6份样品分别用倾注法和涂布法所得的乳酸菌数结果从统计学意义上均无差别。

2.2 三种稀释液中乳酸菌计数结果比较

6份样品经不同稀释液稀释后分别采用涂布法对乳酸菌测定的结果见表2。

3. 讨论：

本实验采用成组设计的两样本均数检验（Independent Sample t Test）分析方法，对6种市售酸奶制品分别采用涂布法和倾注法来计数酸奶中乳酸菌菌落数，结果表明，该两种方法测得的结果之间的差异无统计学意义。根据研究结果显示，涂布法和倾注法对乳酸菌计数无影响是一致的。涂布法培养后乳酸菌生长在琼脂表面，便于挑取菌种做验证试验和保存菌种等，但缺点是其样品稀释液用L形棒涂布必须均匀否则乳酸菌生长不均对结果造成影响[4]倾注法为常规检测方法即样品加样后再倾注培养基混匀进行培养，技术操作简便，样品混匀后能均匀生长，然而培养后菌落大多生长在琼脂内部，如需鉴定试验时会带来一定的困难。另外，通过优化方法不同稀释液中结果比较，6份样品在CYS缓冲液中结果较高。由于生理盐水没有缓冲能力，会导致某些样品不能够溶解和分散充分，影响最终的计数结果。PBS和CYS中磷酸盐可提供缓冲能力，而CYS中L半胱氨酸能够为乳酸菌的生长提供还原性的环境，吐温80能够使菌体分散更充分，为乳酸菌生长提供有利环境。

综上所述，若在一批检测样本数量较多的情况下，仅要求对乳酸菌进行计数的条件下，笔者建议可采用倾注法培养。因为实验表明倾注法与国标推荐的涂布法对乳酸菌计数结果无统计学差异，且倾注法在操作技术上优于涂布法，可大大缩短操作时间，提高实验结果的准确性。另外将CYS作为稀释液更适用于益生菌食品中乳酸菌检验，建议在国标修订时可考虑更换稀释液。

参考文献：

[1]周凌华，王豪，王荫榆，等. 功能性益生乳酸菌的研究进展[J].天然产物研究与开发，2012（7）： 990-995.

[2]GB 4789.35-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

[3]朱宝玉，张秀丽，廖兴，等. 活性乳酸菌制品中乳酸菌计数条件的优化研究 [J].中国卫生检验杂志，2004，14（5）：561-563.

[4]俞漪，曲勤凤，胡雪莲.食品中乳酸菌含量倾注法与涂布法结果差异性研究[J].农产品加工·学刊2012.8（8）：137-139

[5]王彬，马永娟，张少红.培养方式对乳酸菌检出率的影响[J].职业与健康2008.2（3）：225-226.