温阳消饮法对胸腔积液大鼠肾脏AQP2及cAMP—PKA/PKC

李雷兵 张琦 徐建虎

摘要：目的观察温阳消饮法对胸腔积液模型大鼠肾脏水通道蛋白2表达的影响，探究该法治疗水饮病的部分作用机制。方法将Wistar大鼠40只，随机分为温阳消饮组（W），去桂消饮组（Q），模型对照组（M），空白对照组（K）。向W、Q、M组大鼠胸腔注射1%λ-角叉菜胶，制备胸腔积液（悬饮）模型。造模24 h后拍摄X线平片显示造模均成功。于造模2h后给予W、Q组相应药液灌胃，每天1次，连续5天。造模后第5天处死各组大鼠，采集胸腔积液及肾脏组织，用蛋白印迹法检测肾脏AQP2的表达，用酶联免疫吸附法测定cAMP、PKA、PKC的表达。结果①胸腔积液量：与K组比较，各组均增加（P<0.05）；与M组比较，Q、W组减少（P<0.05），与Q组比较，W组较多（P>0.05）。②AQP2：与K组比较，M组降低（P<0.05）；与M组比较，Q、W组升高（P<0.05）；与Q组比较，W组升高（P>0.05）。③PKA：与K组比较，W、Q组增加（P<0.05）；其余各组间（P>0.05）。④PKC、cAMP：与Q组比较，W组cAMP增加（P<0.05）；其余各组间（P>0.05）。⑤肾组织超微结构：与K组比较，M组肾小管上皮细胞表面微绒毛明显减少；与M组比较，W、Q组肾小管上皮细胞表面微绒毛增多；与Q组比较，W组无明显差异。结论①温阳消饮法能有效减少胸腔积液模型大鼠胸腔积液量。②温阳消饮法能上调胸腔积液模型大鼠肾组织AQP2的表达，这可能是该法治疗胸腔积液大鼠的部分作用机制。③温阳消饮法对模型大鼠肾组织的异常变化具有良性、促进恢复的作用。④温阳消饮法对cAMP、PKA、PKC的影响尚不明确。

关键词：温阳消饮法；胸腔积液；大鼠；肾脏；水通道蛋白2

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）07-0078-04

【Abstract】Objective： To observe the effect of Wenyang Xiaoyin method on AQP2 expression of kidney in pleural effusion rats and to explore part of its mechanism of drinking water disease. Methods： Wistar rats were randomly divided into Wenyang Huaxiaoyin group （W）， Qigui Huaxiaoyin group （Q）， model group （M） and blank control group （K）. The rats chests of W， Q and M groups were injected with 1% λ-carrageenan to make pleural effusion （Xuanyinning） model. After modeling for 24 hours， X-ray films were taken to display successful modeling. After modeling for 2 hours， W and Q were given corresponding liquid gavage， once daily for 5 consecutive days. After modeling for 5 days， the rats in each group were sacrificed to collect their pleural effusion and renal tissue. The expression of kidney AQP2 was detected by Western blotting and the expression of cAMP， PKA and PKC was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results： ① pleural effusion： Compared with K， each group increased （P<0.05）； compared with M， Q and W reduced （P<0.05）； compared with Q， W was more （P>0.05）. ②AQP2： Compared with K， M reduced （P<0.05）； compared with M， Q and W increased （P<0.05）； compared with Q， W increased （P>0.05）. ③PKA： Compared with K， W and Q increased （P<0.05）， other groups （P>0.05）. ④PKC， cAMP： Compared with Q， cAMP of W increased （P<0.05）； other groups （P>0.05）. ⑤ renal ultrastructure： Compared with K， renal tubular epithelial cell surface microvilli of M obviously decreased； compared with M， renal tubular epithelial cell surface microvilli of W and Q increased； compared with Q， W was no significant differences. Conclusion： ① Wenyang Huaxiaoyin method can effectively reduce the amount of pleural effusion of pleural effusion model rats. ② Wenyang Huaxiaoyin method can increase the expression of AQP2 in renal tissue of pleural effusion model rats， which may be part of the mechanism of the method. ③ Wenyang Huaxiaoyin method has benign and restoring function for abnormal changes of renal tissue model rats. ④ The effect of Wenyang Huaxiaoyin method is not yet clear for cAMP， PKA and PKC.

【Key words】Wenyang Huaxiaoyin method， pleural effusion， rats， kidney， aquaporin 2

水饮是中医对病因、病理产物的一种独特认识，是人体津液代谢失常，导致水液不能正常运化，停积于人体局部所形成的一种病理产物。文献研究与临床实践已经证实，胸腔积液是悬饮的代表性疾病。人体水液的代谢与肺脾肾三焦关系密切，水饮的形成与肺气宣降、脾阳温运、肾阳温化、三焦通达等功能的失常密切相关，“肾者，水脏，主津液”（《黄帝内经·素问》），肾是人体水液运行、敷布、排泄的重要脏器，肾的气化功能不仅是人体水液代谢的动力之一，肺宣发肃降津液、脾转化运输津液的动力之根，同时维持着机体水液代谢的平衡。

“病痰饮者，当以温药和之”为水饮病治本大法，此法被后世医家奉为治疗水饮病的圭臬。仲景所创的苓桂术甘汤为“温药和之”的代表方，具有温阳健脾、利水蠲饮之功，侧重于温阳治本；葶苈大枣泻肺汤泻肺行水，侧重于消饮治标。AQPs是一组细胞膜转运蛋白，在水液的跨膜转运中发挥着重要作用，对机体各脏腑组织水液吸收、液体分泌以及各细胞、组织、器官、全身的水液代谢平衡起着重要作用。本研究选择苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤作为温阳消饮法的代表方，并以上方去桂枝作为对比，试图观察温阳消饮法代表方、去桂消饮方对胸腔积液大鼠肾脏水通道蛋白2表达影响有无差异，以探讨该法消除水饮的部分作用机制，并观察以桂枝为代表的温阳药在此法中的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物成都达硕生物科技有限公司提供SPF级成年Wistar大鼠40只（雌雄各半），平均体重180～230 g。

1.1.2药物与主要试剂苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤所有生药购自成都市国际商贸城荷花池中药材专业市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品。λ-角叉菜胶粉剂（Sigma 公司，产品批号：0009064577）及戊巴比妥钠（Sigma 公司，产品批号：69020100）。

1.2方法

1.2.1动物分组采用计算机随机分组方法，将其分为4组即W组（温阳消饮组，10只），Q组（去桂消饮组，10只），M组（模型对照组，10只），K组（空白对照组，10只）。每组雌雄各半，并予以标号。

1.2.2动物模型建立与评价对M、W、Q组大鼠参照文献[1]，以1.5%戊巴比妥钠（0.25 mL/100 g大鼠体重）腹腔注射麻醉，将进入麻醉状态的大鼠依据体重，向右侧胸膜腔（第3或第4肋间隙）一次性注入1%λ-角叉菜胶溶液（雌性0.8 mL/只，雄性1.0 mL/只），制成渗出性胸膜炎大鼠模型。

动物于造模24h后进行模型评价。予以1.5%戊巴比妥钠麻醉，经高频全自动动物X-光机拍片，在CR数字成像系统下对右侧胸腔病变情况进行观察，3组大鼠均造模成功（见图1、图2）。

如图1、图2，X平片所示：大鼠右侧肋膈角变钝，肺野呈均匀致密阴影，肋间隙变宽，纵膈向健侧移位。故可以判断为大鼠右侧胸腔积液。

1.2.3中药煎剂的制备及给药方法根据仲景《金匮要略》记载的苓桂术甘汤和葶苈大枣泻肺汤的药物组成比例，即：茯苓：桂枝：白术：生甘草为4∶ 3∶ 3∶ 2，葶苈子：大枣为6∶5。按照《药典》有关制剂要求，采用合煎形式，制成苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤（温阳消饮代表方）药液、苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤去桂枝（去桂消饮方）的药液（2 g生药/mL）。于造模2 h后，W组给予温阳消饮代表方药液灌胃给药，去桂消饮组给予去桂消饮方药液灌胃给药，药物剂量按照成人日用量与大鼠体表面积折算为等效剂量（5 mL/kg）[2]，每日灌胃给药1次，连续5 d。K、M组常规饲养，未施加任何处理措施。

1.2.4标本采集分别于造模后第5天处死各小组动物。以1 mL一次性注射器抽取胸腔积液，剪取双侧肾脏，分别固定于4%多聚甲醛固定液中，以备进行相关检测。

1.2.5统计分析数据统计采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，检测数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步的两两比较采用Bonferroni检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肾脏AQP2表达情况比较 结果见表1及图3。

由表1可知，与空白对照组比较，模型对照组表达降低（P<0.05）；与模型对照组比较，温阳消饮组、去桂消饮组表达均升高（P<0.05）；与去桂消饮组比较，温阳消饮组表达虽有升高，但不具有统计学意义（P>0.05）。

2.2肾脏cAMP、PKA、PKC的含量，胸腔积液量比较结果见表2。

由表2可知，胸腔积液量：与空白对照组比较，各组胸腔积液量均增加（P<0.05）；与模型对照组比较，去桂消饮组、温阳消饮组胸腔积液量减少（P<0.05），与去桂消饮组比较，温阳消饮组胸腔积液量较多，但不具有统计学意义（P>0.05）。肾脏PKA含量：与空白对照组比较，温阳消饮组、去桂消饮组PKA含量增加（P<0.05）；其余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。肾脏PKC、cAMP含量：与去桂消饮组比较，温阳消饮组cAMP增加（P<0.05）；其余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3肾脏组织超微结构与空白对照组（图4）比较，模型对照组（图5）肾小管上皮细胞表面微绒毛（a）明显减少；与模型对照组比较，温阳消饮组（图6）、去桂消饮组（图7）肾小管上皮细胞表面微绒毛增多；与去桂消饮组比较，温阳消饮组无明显差异。

3讨论

津液代谢与人体各脏腑生理机能的正常都密切相关，其中以肺、脾、肾及三焦的功能正常尤为重要，它们共同参与完成人体津液的正常生成、输布、排泄的复杂过程。《素问·逆调论》曰：“肾者水脏，主津液”、“肾为水之下源”等论述说明肾脏在人体水液输布、排泄过程中发挥着重要作用。津液代谢失常、水饮停聚为患的痰饮类疾病与肺、脾、肾及三焦的生理机能失常密切相关。痰饮学说源于《内经》、始见于《金匮要略》，痰饮是人体水液代谢失常所形成的一种病理产物，同时也是一种新的致病因素（继发性病因），作用于人体导致脏腑功能失调，继发各种复杂的病理变化。痰饮为阴邪，其形成与人体阳气的失宣、不运、不化有关，其形成后最易损伤人体阳气，妨碍阳气的温煦、推动、气化。因此对于痰饮类疾病要重视阳气的恢复，临床常常借助于温药以振奋阳气，使其温运、蒸腾气化功能复常，从而消除水饮病邪。《金匮要略》提出“病痰饮者，当以温药和之”的痰饮病的治疗大法，此法受到历代医家的推崇。苓桂术甘汤和葶苈大枣泻肺汤对痰饮类的疾病均有治疗作用，临床当中常将两方合用，用于对多种病因导致的胸腔积液类疾病的治疗。如在羟基喜树碱配合中药治疗恶性胸腔积液的临床观察中发现：羟基喜树碱胸腔化疗配合中药苓桂术甘汤和葶苈大枣泻肺汤加减治疗恶性胸水，近期效果明显，毒副反应小，安全可靠，能够明显延长胸水复发的时间，降低了治疗成本[3]。

AQP2位于集合管主细胞管腔和靠近管腔侧的囊泡内，是肾脏分布最多的一种AQPs，也是对抗利尿激素敏感的水通道蛋白。当精氨酸加压素水平增高后，细胞质内的囊泡与管腔细胞膜融合，AQP2通过出胞运动转移至管腔细胞膜上，使管腔侧细胞膜上AQP2数量增加，对水的通透性增高[4]。本课题组在先期实验当中已发现温阳消饮法可上调胸腔积液大鼠肾脏AQP2表达[5]，本实验通过去除桂枝，旨在探讨以桂枝为代表的温阳药物在本法当中的作用及对AQP2的影响差别。

本实验研究发现，温阳消饮法能够明显减少胸腔积液模型大鼠的胸腔积液量。与Q组比较，W组胸腔积液量较多，无统计学意义，这可能是由于本实验动物未造成阳虚模型，虽与悬饮病相似，而无阳虚证有关，桂枝在温阳消饮方中作用尚不明确。温阳消饮法上调模型大鼠肾脏组织AQP2的表达，从而增加肾脏对水液的重吸收作用。该研究结果与既往的研究结果一致[5]。当水饮停聚胸胁时，肾主水的功能受到影响，所以M组的APQ2表达明显下降，当予以温阳消饮法治疗后，通过其健脾蠲饮、温阳行气的作用，增强悬饮模型动物的肾脏AQP2的表达使之恢复或接近正常水平。W组与Q组比较虽有增强但不明显，说明桂枝在此模型中对肾脏组织AQP2的影响作用并不十分明显，具体作用机制尚需进一步研究。对cAMP-PKA/PKC信号通路的影响作用机制尚不明确，cAMP-PKA/PKC信号通路对AQP2的影响亦不确定，对此有待进一步研究。微绒毛的功能是通过增大细胞表面，扩大吸收面积，参与细胞的吸收功能。与K组比较，M组微绒毛明显减少，说明λ-角叉菜胶胸腔注射不仅引起胸腔的炎性变化，还对肾脏组织有影响，使肾主水的功能失常，同时从侧面证明人体是一个有机整体，某处的病变对全身脏腑的正常运转都有影响。温阳消饮法能够明显增多微绒毛，使肾脏对水液的重吸收增强，发挥其主水的作用。

参考文献：

[1]Cuzzocrea S，Mazzon E，Calzbro G，et al.Inducible nitric oxidensynthase-knockout mice exhibit resistance to pleurisy and lung in jury caused by carrageenan[J].Am J Respir Crit Care Med，2000，162：1589-1866.

[2]魏伟，吴希美，李元建.药理实验方法学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2010：1698.

[3]倪敏，欧阳学农，戴西湖.羟基喜树碱配合中药治疗恶性胸腔积液的临床观察[J].实用医技杂志，2003，18（4）：399-400.

[4]Noda Y，Sasaki S.Molecular mechanisms and drug development in aquaporin water channel diseases：molecular mechanism of water channel aquaporin-2 trafficking[J].J Pharmacol Sci.2004.96（3）：249-54.

[5]李思思，张琦，赖宇，等.温阳消饮法对胸腔积液模型大鼠肾脏水通道蛋白2表达影响的研究[J].四川中医，2014，32（5）：69-70.