红花紫荆叶总黄酮提取工艺及其抑菌和抗氧化活性

黄素华　林标声　江龙

摘要：研究了超声波提取红花紫荆叶黄酮的条件及其抗菌、抗氧化的性能。结果表明，经过正交试验分析，总黄酮最佳提取工艺为乙醇体积分数60%，超声时间45 min，超声温度70℃，料液比1：20（m：V），该条件下总黄酮提取率为4.11%。红花紫荆叶总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有抑菌效果，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，对青霉的抑菌效果不明显：红花紫荆叶总黄酮对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌最小抑菌溶度为0.025 g/mL，对白色念珠菌最小抑茵浓度为0.05g/mL，对青霉最小抑菌浓度为0.6g/mL。红花紫荆叶总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸盐均具有一定的清除作用，在浓度0.5～2.5mg/mL的范围内，清除能力随着浓度的增加而增强，且强于阳性对照维生素c的清除能力，抗氧化能力较强。

关键词：红花紫荆；总黄酮；提取工艺；抑菌；抗氧化

红花紫荆，为豆科（Lgemuniosae）羊蹄甲属常绿中等乔木。羊蹄甲属植物在全世界约有600种，遍布于世界热带地区，中国约有40种，4个亚种，11个变种，主产于南部和西南部。红花紫荆为华南地区最常见的绿化观赏树。羊蹄甲属植物在亚洲、非洲、中美洲、南美洲作为民间用药，其根皮、茎皮及叶的提取物可治疗腹泻、风湿病和糖尿病。目前，对羊蹄甲属植物化学成分和药理活性的研究主要包括其化学成分的分离与鉴定、生物碱的抗肿瘤、茎皮提取物的保肝及抑菌研究。羊蹄甲属植物主要含有黄酮类、酚酸类、甾醇类。红花紫荆化学成分和药理活性的研究鲜见报道。黄酮类化合物在羊蹄甲属植物中普遍存在，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、抗肿瘤等功效。红花紫荆在中国南方资源非常丰富，由于其树美花艳，是园林和城市美化的首选树种，但其药用价值却没有得到有效开发。本试验以红花紫荆为材料，采用超声波乙醇法提取红花紫荆叶总黄酮，分析红花紫荆总黄酮最佳工艺并进行抑菌、抗氧化活性的研究，为红花紫荆的开发、利用提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料 红花紫荆叶采自龙岩学院校园，洗涤干净后于干燥箱中45℃烘干。用微型植物粉碎机粉碎，密封于4℃冰箱保存。

1.1.2菌种及培养基 细菌：金黄色葡萄球菌（G+）及大肠杆菌（G-），牛肉膏蛋白胨培养基培养。霉菌：青霉，马丁氏培养基培养。酵母：白色念珠菌，马铃薯培养基培养。

1.2方法

1.2.1超声波乙醇法提取红花紫荆叶总黄酮 参照陶亮亮等总黄酮超声波提取方法，以NANO2-AI（NO3），比色法提取红花紫荆叶中的总黄酮。精确称取5 g红花紫荆叶粉末，按设定的料液比加入不同体积分数的乙醇进行超声波试验。选择料液比（m：V，g/mL，下同）、乙醇体积分数、超声波时间、超声温度4因素，进行L（3）正交试验，以红花紫荆叶中的总黄酮得率为指标进行考察，正交试验因素和水平见表1。总黄酮得率=总黄酮含量/样品质量×100%。在提取液中测定总黄酮含量，以绘制的芦丁标准曲线为参照进行计算，所得的芦丁标准曲线方程为Y=0.076 3X-0.000 2，R2=0.999 2.芦丁标准液浓度为0.2 mg/mL。

1.2.2红花紫荆叶总黄酮的抑菌试验 将所得总黄酮配制成浓度分别为0.6、0.4、0.2、0.1 g/mL的溶液。将4种供试菌种活化，制成浓度为1×10⁸个/mL的菌悬液。取100 μL菌悬液注入各自适合的平板内，并用涂布棒将菌液涂布均匀。采用牛津杯法测定不同浓度总黄酮的抑菌能力。各平板牛津杯中加入样品溶液50μL，以无菌去离子水为对照。样品溶液加好后，细菌放置于37℃培养箱中，霉菌和酵母置于28℃培养箱中培养24 h。测定各样品形成的抑菌圈大小，每种菌种按上述步骤重复3次。

总黄酮最小抑菌浓度（MIC）试验：根据抑菌试验结果，将红花紫荆总黄酮配制成质量浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.0125 g/mL的溶液，再按照上述步骤进行试验，测定MIC。

1.2.3红花紫荆叶总黄酮的抗氧化试验 参照孟良玉等的研究方法，测定红花紫荆总黄酮的抗氧化活性，包括对羟自由基的清除作用、对超氧阴离子自由基的清除作用、对亚硝酸盐的清除作用，3个试验均以维生素c为阳性对照，计算其清除率，各试验均3次重复，取平均值。

2.结果与分析

2.1正交试验结果

由表2可知，3个影响因素中，对红花紫荆叶总黄酮含量影响的大小顺序为D、C、B、A，即乙醇体积分数>超声时间>超声温度>料液比，最优因素水平组合为A2B3C3D2，即料液比1：20，超声温度70℃，超声时间45 min，乙醇体积分数60%。在最佳提取工艺下对红花紫荆叶总黄酮进行提取，3次重复，总黄酮的提取率为4.11%。经过D101大孔树脂分离纯化后，总黄酮的得率为3.38%。

2.2红花紫荆叶总黄酮的抑菌试验结果

由表3可知，红花紫荆叶总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均有较好的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果尤为明显，但对青霉的抑菌效果不明显。在一定范围内，随着红花紫荆叶总黄酮浓度的升高，抑菌效果增强。

由表3、表4可知，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.025 g/mL，白色念珠菌的最小抑菌浓度为0.05 g/mL，青霉的最小抑菌浓度为0.6g/mL。

2.3红花紫荆叶总黄酮的抗氧化试验

红花紫荆叶总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸盐的清除作用结果见图1、图2、图3。结果表明，在0.5-2.5 mg/mL的浓度范围内，随着红花紫荆叶总黄酮浓度的升高，其对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸盐的清除作用越强，抗氧化能力越强，最大清除率分别达到68.27%、61.16%、25.75%：红花紫荆叶总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除作用要强于对亚硝酸盐的清除作用：相对于阳性对照维生素c，红花紫荆叶总黄酮对这3种物质的清除能力更强，说明其具有较好的抗氧化作用。

3.小结

试验表明，红花紫荆叶黄酮提取的最佳条件是乙醇体积分数60%，超声时间45 min，超声温度70℃，料液比1：20。影响因素的大小顺序为乙醇体积分数>超声时间>超声温度>料液比。最佳提取条件下，黄酮的提取率为4.11%。在红花紫荆叶总黄酮抑菌活性研究中，总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有较强的抑菌作用，对青霉的抑菌作用不明显。最小抑菌浓度也有较大差异，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.025g/mL，对白色念珠菌的最小抑菌浓度为0.05 g/mL，对青霉的最小抑菌浓度为0.6 g/mL。红花紫荆叶总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸盐均具有一定的清除作用，在0.5～2.5 mg/mL的浓度范围内，清除能力随着浓度的增加而增强，且强于阳性对照维生素c的清除能力，抗氧化能力较强。本试验研究了红花紫荆叶片总黄酮的提取及抑菌、抗氧化作用，旨在为校园绿化树种的选择及植物抗氧剂、抗衰老保健药品的开发与利用提供理论参考。