萝卜游离小孢子成胚诱导影响因素研究进展

李晓梅 冉茂林 杨峰

摘 要：综述了影响萝卜小孢子培养中胚状体发生的主要因素，包括基因型、小孢子发育时期、小孢子的处理方式、培养基类型及其添加物等，同时提出了该技术存在的问题，并展望了这项技术在研究和生产实践中的应用前景。

关键词：萝卜；游离小孢子培养； 胚状体诱导；影响因素

中图分类号：S631.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2016）14-0041-04

萝卜（Raphanus sativus L.）为十字花科萝卜属的一二年生草本植物，以肥大肉质根为产品器官，是我国重要的蔬菜作物。异花授粉作物的杂种优势明显，在萝卜杂交优势育种中，人们多利用雄性不育系与自交系所产生的F1代的杂种优势来提高其品质、产量和抗病性。遗传性稳定的纯合自交系是必不可少的亲本材料，常规选育方法获得一个稳定、纯合的自交系一般需要7～8代，费工费时，且长期自交还会出现衰退现象。而运用游离小孢子培养获得纯系是一种行之有效的方法，运用该技术可在2 a内获得遗传稳定的双单倍体（Doubled haploid，DH）植株，从而大大缩短育种周期，提高育种效率。同时由于隐性性状能在DH植株上直接表达，可提高优异重组体与突变体的选择效率，除此之外DH植株还可用于遗传图谱的构建与分子标记等基础研究，小孢子和小孢子胚也是遗传转化的理想受体，因此小孢子游离培养技术应用前景广阔[1]。

1989年，Lichter[2]首次通过小孢子培养技术成功获得萝卜胚状体。此后，国内外诸多学者对萝卜游离小孢子技术开展了系统的研究。本文对20多a来国内外有关萝卜游离小孢子培养所取得的成果及其影响因素进行综述，并以此提出萝卜小孢子培养中现存的问题以及对未来的展望。

1 影响萝卜小孢子成胚诱导的内在因素

1.1 供体材料的基因型

供体植株的基因型是影响小孢子培养的关键因素，是小孢子胚胎发生起动与否的内在因素，且不同基因型之间小孢子胚胎的发生频率存在显著差异。1996年，Takahata等[3]对11份萝卜材料进行游离小孢子培养，其中只有6份材料获得了胚状体，其基因型发生范围为54.5%，胚胎发生率为0.2～8.3个/105个游离小孢子。随后张丽[4]用20个不同类型萝卜品种为试材，进行游离小孢子培养技术初步研究，发现只有山东板叶心里美1个品种能够形成胚，陈文辉等[5]、周志国等[6]、张振超[7]的研究同样证实了不同基因型萝卜胚状体发生率间存在显著差异。王春丽等[8]进一步研究发现，在22份萝卜材料中，有12份材料获得了胚状体，出胚材料中90%以上为杂种一代，表明萝卜杂种一代较常规品种易出胚，这与赵艳玲[9]的研究结果一致，可能的原因是萝卜胚胎发生能力同其他被证实了的十字花科作物一样，是受染色体上某些基因位点控制，因而表现出较强的杂种优势。

1.2 小孢子发育时期

大多数植物小孢子培养的最佳时期为单核靠边期至双核早期，然而小孢子的发育时期与花蕾形态指标相关。花蕾长度是最早用于判定萝卜小孢子发育时期的外在标准。Takahata等[3]发现萝卜材料Chugoku-ao、Sushirazu-shogoin及Minikon的花蕾长度分别为3～4 mm、5～6 mm、4～5 mm时，其小孢子处于单核靠边期至双核早期，此时培养的小孢子胚状体诱导率最高；周志国等[6]、龙雯虹[10]同样证实，不同基因型的小孢子处于单核靠边期至双核早期的花蕾长度不同。李丹等[11]以4份不同萝卜材料为试材，研究了花蕾不同形态指标与小孢子发育时期的关系，结果表明不同材料花蕾纵径、花蕾横径、花瓣长、花药长存在极显著差异，试验材料处于单核靠边期时的花蕾纵径变幅为2.99～3.51 mm，横径为2.11～2.49 mm，花蕾纵横径比为1.41～1.48，花药长度为2.05～2.51 mm，花药宽度为0.83～0.95 mm，花瓣长度为1.89～2.56 mm，瓣药比为0.92～1.06，相比较而言，小孢子发育适期瓣药比在不同材料间的差异相对较小，更适合作为不同材料取样适期的鉴定指标和尺度，这与赵艳玲[9]的研究结果一致。Changhoo等[12]的研究表明，不同萝卜品种小孢子培养最佳花蕾长度在2.5～6.5 mm，但其总体特征是当花瓣约短于柱头长度时小孢子处于单核晚期的比例最大。虽然花蕾形态可作为判断小孢子发育时期的指标，但它随着供体植株基因型、生长条件、生长时间、花序等的变化而变化，故在每次培养前，应对小孢子发育时期进行鉴定。

2 影响萝卜游离小孢子成胚诱导的外因

2.1 材料的处理

在进行小孢子培养时对其进行处理，可改变小孢子的生理状态，使分裂方式和发育途径发生变化，促进胚状体的形成，提高胚状体发生率，这项措施在诸多植物上取得了成功。应用在萝卜小孢子培养中的处理方式主要有低温、热激、饥饿胁迫、添加甘露醇与秋水仙素等方法。

①低温预处理 据许多研究者报道，低温处理可改变花粉第2次有丝分裂的轴向，使正常的不对称的有丝分裂被破坏而进行对称分裂，形成2个均等的细胞，从而向孢子体途径发展。在进行小孢子培养之前，对花序上的花蕾进行低温预处理，可提高胚状体的诱导。陈文辉等[5]证明3℃低温处理24 h可显著提高材料胚诱导率，但随着处理时间的延长，诱导率反而下降，超过48 h小孢子不发育。付传翠等[13]则认为，4℃低温处理3 d可提高小孢子存活率，但随着时间推迟其存活率下降。李丹[14]认为不同基因型材料适宜的低温处理时间不同，萝卜小孢子低温预处理的适宜时间为1～3 d，小孢子的存活率随时间的延长呈下降趋势。然而白小娟等[15]、王春丽等[8]则认为单纯的低温处理对小孢子的发育没有影响。

②高温热激处理 自从Keller等[16]在甘蓝型油菜花药培养中，首次用高温处理提高花粉胚的诱导率获得成功后，该方法被广泛应用于植物游离小孢子培养中。其作用机理可能是高温处理改变了小孢子发育途径，阻止小孢子向成熟花粉粒方向发展，从而促进其由配子体发育转变为小孢子体发育而诱导胚的形成。Takahata等[3]首次研究表明，32.5℃高温处理是萝卜小孢子胚状体发生的必须条件，但其最佳时间随着基因型变化而变化。赵艳玲[9]对3个萝卜材料用32.5℃高温热激处理（0、24、48、72、96 h）后，发现当3种基因型热激0、96 h时小孢子存活率和胚状体诱导率全是0，说明小孢子没有经过高温热激就不能膨大进而启动分裂，而热激96 h后的小孢子可能经过长时间的高温已经死亡，当小孢子热激48 h存活率和胚状体诱导率与其他4个处理呈显著差异。大量研究表明，高温热激处理可显著提高萝卜小孢子成胚诱导率，甚至是诱导成胚的必要条件，其最佳处理温度为32～33℃，最佳处理时间为24～48 h[5～8，10～12，15]。

③其他处理方式 在萝卜小孢子培养中，见报道的除上述2种处理方式外，还有饥饿胁迫、添加甘露醇及秋水仙素等处理方式。付传翠等[13]研究表明，饥饿处理反而会降低萝卜小孢子成活率，甘露醇及秋水仙素处理能提高萝卜小孢子存活率，在4份供试材料中3份最适甘露醇处理浓度为5 g/L，1份为15 g/L，而2份材料最适秋水仙素处理浓度为20 mg/L，另2份材料分别为5、10 mg/L。李丹[14]研究了不同浓度甘露醇及处理时间对4份萝卜材料小孢子存活率的影响，结果在4份材料中，有1份材料对甘露醇不敏感，2份材料经10、15 g/L 的甘露醇预处理后，可保持较好的存活率，还有1份材料经10 g/L甘露醇处理后有较高的小孢子存活率，但是随着处理时间的延长而下降，可见不同基因型萝卜最佳甘露醇或秋水仙素处理浓度不同，这与白小娟等[15]的研究结果一致。

2.2 培养基类型及添加物

①基本培养基及蔗糖浓度 萝卜游离小孢子成胚诱导培养中最常用的是NLN或1/2 NLN基本培养基，其主要特点是大量元素含量较低。陈文辉等[5]研究了NLN与1/2 NLN对萝卜小孢子胚诱导的影响，发现只有1/2 NLN培养基才能诱导萝卜小孢子产生胚状体，然而赵艳玲[9]则认为NLN与

1/2 NLN均可很好地用于萝卜游离小孢子成胚诱导。蔗糖是小孢子培养中的主要碳源，用来提供能量和维持细胞的渗透压。有些学者认为，高浓度蔗糖可维持小孢子的活力。目前，萝卜游离小孢子培养中使用的蔗糖浓度一般为13%[4，6，14]，但陈文辉[5]认为12%蔗糖浓度最适宜萝卜游离小孢子培养，而Changhoo等[12]比较了1/2 NLN 添加不同浓度蔗糖（10%、13%、15%、20%）对萝卜小孢子胚诱导的影响，发现低于10%无胚状体产生，适宜成胚诱导的最优蔗糖浓度为15%，其胚产量可达2.4个/蕾。

②激素 在培养基中，激素的成分对诱发细胞生长与分裂起重要作用，在萝卜游离小孢子培养中，外源激素对胚形成和植株再生的影响至今没有取得一致的结果。Lichter[2]最早报道，在培养基中除去植物生长调节剂可提高胚产量。周志国等[6]研究发现，在萝卜小孢子培养中添加6-BA可明显促进萝卜游离小孢子胚状体的诱导，当浓度为0.1 mg/L时胚产量最高，但畸形胚发生率增加，这与赵艳玲[9]的研究结果一致。李丹[14]则认为添加0.1 mg/L

6-BA+1 mg/L NAA为萝卜小孢子成胚诱导的最佳激素组合。在实际工作中，大多数均采用不添加激素的培养方式。

③活性炭和硝酸银 在小孢子离体培养中，无胚胎发生能力的小孢子能释放出一些有毒物质，可能会抑制具有胚胎发生能力小孢子的胚胎发生及胚状体的正常发育，因此，在小孢子离体培养中常常会添加一些抑制剂来阻止有害物质的影响，常用的添加物为活性炭和硝酸银。Lichter[2]指出，活性炭不仅可以吸附培养基中有毒物质，还可以吸附一些必要元素和植物激素，因此，活性炭的浓度不宜太高，否则会起负作用。周志国等[6]认为，添加活性炭可提早出胚时间3～5 d，当加入活性炭浓度为0.8 g/L 时，胚诱导率最高。赵艳玲[9]的研究表明，活性炭最适添加浓度为0.75 g/L，王康[17]研究表明活性炭最适添加浓度为0.1 g/L，张丽等[18]则认为单纯添加0.1 g/L活性炭对春白萝卜离体小孢子成胚没有明显的促进作用，需要与4℃低温处理相结合才能促进胚状体的发生。硝酸银为乙烯抑制剂，Changhoo等[12]比较了不同浓度硝酸银对萝卜游离小孢子培养的影响，发现0.05 mg/L 硝酸银为最适浓度，其胚产量为不添加硝酸银的2倍多，但浓度超过1.0 mg/L后则无胚状体产生。王康[17]研究发现，添加1～2 mg/L 硝酸银可提高一些基因型的胚状体发生频率，而且在胚状体诱导愈伤组织产生次生胚的过程中，硝酸银的添加对次生胚的诱导也起到了一定的促进作用。

3 存在的问题与展望

萝卜游离小孢子培养研究虽然取得了一定进展，但相对于其他十字花科作物而言其研究深度与广度还差之甚远。萝卜游离小孢子培养技术难点主要表现为成胚诱导能力基因型限制性强、小孢子成胚诱导频率低以及培养结果重复性差等。现已证实小孢子胚胎发生能力同其他遗传性状一样，是一种受基因调控的遗传特性[19，20]，因此，可利用品种杂交的手段，将控制高胚胎发生能力的遗传因子导入到无胚胎或低胚胎发生能力的基因型中，通过遗传改良的方法扩大萝卜小孢子胚胎发生的基因型范围。同时通过优化小孢子培养的各种因素建立完善、高效的再生体系，并使之与常规育种技术相结合应用到育种工作中将是以后研究的重点。另外，应逐步扩大萝卜游离小孢子技术的应用范围，将该技术应用于萝卜种质创新、遗传转化、分子标记、遗传图谱构建等领域。我们相信，萝卜游离小孢子培养技术不仅会成为常规育种的一个重要组成部分，而且必将在基础研究领域发挥更大的作用。

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