川木通红外光谱指纹图谱的建立及其与相近中药的鉴别

高姗姗 李建蕊 吴方斌 韦学敏 卞金辉 陈建波 程世琼 孙素琴 吕光华

[摘要]川木通为常用的利尿通淋药；因多来源于野生药材，性状特征差异大，有效成分及特征性成分不明，难以鉴别。为了建立准确鉴别川木通的方法，该研究收集了24份川木通和7份相近中药木通和关木通样品，利用傅里叶变换红外光谱技术测定4 000～400 cm-1的一维和二维相关红外光谱。首先随机选取20份川木通样品为校正集样品，发现其红外光谱的峰形、峰位、峰强相似，相关系数大于0994 3；以其模拟平均红外光谱为指纹图谱，其特征峰位于3 412，2 932，1 739，1 639，1 509，1 456，1 426，1 376，1 332，1 261，1 159，1 035，897，609 cm-1等。然后，根据统计学的“3σ规则”，计算用红外光谱相关系数判别川木通真伪的域值（Mean-3σ=0992 6）。再用另外4份川木通样品、4份关木通和3份木通样品检验该指纹图谱鉴别川木通的效果。结果表明，这4份川木通的红外光谱均与指纹图谱相似，相关系数也大于域值而判别为川木通；而关木通和木通与川木通的指纹图谱明显不同，相关系数均小于域值而判别为非川木通。进一步比较了川木通、木通、关木通的二维相关红外光谱，发现自动峰和交叉峰数目、位置、强度等特征均不同。由此可见，建立的川木通红外光谱指纹图谱可用于川木通的真伪鉴别，为川木通提供了一种简便、快速鉴别的新方法。

[关键词]川木通；关木通；木通；红外光谱；指纹图谱；相关系数；鉴别

[Abstract]Armand clematis stem （Clematidis Armandii Caulis， Chuanmutong） is a widely used Chinese herb to disinhibit urine and relieve stranguria It is difficult to be identified owing to its various macroscopic feature and unknown characteristic compounds Thus， total of 24 Chuanmutong samples and 7 related herbs including four manshurian aristolochia stem （Aristolochiae Manshuriensis Caulis， Guanmutong） and three akebia stem （Akebiae Caulis， Mutong） samples were collected and analyzed in the range of 4 000 400 cm-1 by Fourier Transform Infrared （FTIR） and twodimensional infrared correlation spectroscopy （2DFTIR） techniques The FTIR spectra of 24 Chuanmutong samples are consistent in the spectrum profiles， position and intensity of characteristic peaks 20 of the 24 Chuanmutong samples were randomly selected as calibration samples to calculate and simulate mean spectrum This mean spectrum is named as FTIR fingerprint of Chuanmutong with characteristic peaks at 3 412， 2 932， 1 739， 1 639， 1 509， 1 456， 1 426， 1 376， 1 332， 1 261， 1 159， 1 035， 897 ，609 cm-1 Meanwhile， the limited level （Mean-3σ=0992 6） to identify true or false Chuanmutong by correlation coefficient of FTIR spectra was calculated based on the 20 Chuanmutong calibration samples Then， the rest 4 Chuanmutong， 4 Guanmutong and 3 Mutong samples were used as validation samples to evaluate the identification efficacy The result shows that the FTIR spectra of 4 Chuanmutong validation samples were similar to the fingerprint Their correlation coefficients of FTIR spectra were over the limited level and accepted as Chuanmutong However， the spectra of Guanmutong and Mutong were significantly different from Chuanmutong fingerprint The correlation coefficients of Guanmutong （0902 10940 4， n=4） and Mutong （0954 90978 9， n=3） FTIR spectra were less than the limited level and rejected from Chuanmutong Furthermore， the number， position and intensity of autopeaks on the 2DFTIR were drastically different among the three herbs It is concluded that the developed FTIR fingerprinting can be rapidly and accurately identify Chuanmutong and differentiate from related herbs

[Key words]Clematidis Armandii Caulis； manshurian aristolochia stem； akebia stem； Fourier transform infrared； fingerprint； correlation coefficient； identification

doi：10.4268/cjcmm20160820

川木通为常用中药，具有利尿通淋，清心除烦，通经下乳之功效；来源于毛茛科植物小木通Clematis armandii Franch或绣球藤C montana Buch Ham的干燥藤茎[12]。由于川木通多为野生药材，再加上地方习用品等原因，导致商品川木通的品种混淆、混用[34]。尤其是川木通与木通、关木通混淆。这3种相近中药曾经称为“木通类”中药，其功效或临床应用不同，原植物也不相同。中药木通来源于木通科植物木通Akebia quinata （Thunb） Decne、三叶木通A trifoliate （Thunb） Koidz和白木通A trifoliate （Thunb） Koidz var australis （Diels） Rehd的干燥藤茎，也是《中国药典》收载的中药品种[12]。虽然其有效成分、药理作用和主治功能与川木通相近，但临床应用各有侧重，区别使用[5]。关木通曾收载于2000年版《中国药典》中，来源于马兜铃科植物东北马兜铃Aristolochia manshuriensis Kom 的干燥藤茎；因其产量高，曾经是“木通类”中药的主要品种[6]。但因关木通含马兜铃酸类成分，具有肾脏毒性[78]，于2003年被国家药品监督管理局禁用[9]。并且，世界上许多国家严禁使用含马兜铃酸类成分的药物[10]。因此，川木通与木通、关木通不能混用。然而，在2010年版和2015年版《中国药典》中，川木通既无真伪鉴别的特征性成分，又无质量评价的指标性成分，难以保证川木通品种的准确性和中医药的临床疗效。因此，亟待通过研究，建立准确、快速鉴别川木通的新方法。

红外光谱是物质中分子的吸收光谱，能反映样品的化学成分信息。不同中药的化学成分不同，其红外光谱也不同，各具指纹特征。并且，红外光谱具有操作简便、快速的优点，能有效地鉴定和控制中药的质量[1112]。同时，二维相关红外光谱（twodimensional infrared correlation spectroscopy，2DFTIR）展现了外界扰动下产生的光谱特征，与常规红外光谱（一维红外光谱）相比，提供了更多的化学成分信息，具有更高的分辨率[1314]。为此，本研究从不同产地和中药材市场收集了24份川木通样品及其7份相近中药（木通和关木通）样品；运用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared， FTIR）技术，测定一维红外光谱（以下称为“红外光谱”）和二维相关红外光谱。通过分析光谱特征，建立川木通红外光谱指纹图谱；并运用统计学分析，计算用红外光谱相关系数判断川木通真伪的域值。并进一步用木通和关木通检验川木通指纹图谱的鉴别作用；为川木通提供一种准确、快速的红外光谱鉴别方法。

1材料

11仪器及测定参数

傅里叶变换红外光谱仪为Spectrum One（美国PerkinElmer公司），DTGS检测器。YP2压片机（上海山岳科学仪器有限公司）。压片模具（美国PerkinElmer 公司），直径13 mm。变温附件为Portable Controller可编程温度控制单元（50886型）（Love Control公司）。

红外光谱的扫描范围为4 000～400 cm-1，每张光谱累加扫描16次，分辨率为4 cm-1，扫描过程中实时扣除二氧化碳和水蒸气干扰。

红外光谱处理软件为Spectrum v 632（美国PerkinElmer公司）；二维相关红外光谱软件由清华大学设计。

12药品及药材样品

溴化钾（KBr，光谱纯）碎晶购于四川省自贡市化工研究设计院。

24份川木通样品和7份易混中药关木通和木通样品分别从不同产地、中药材专业市场及医药公司等收集（表1），由成都中医药大学吕光华教授鉴定。样品S1～S24为中药川木通的原植物（毛茛科植物小木通C armandii或绣球藤C montana的干燥藤茎；S25～S28为中药关木通的原植物（马兜铃科植物东北马兜铃A manshuriensis的干燥藤茎；S29～S31为中药木通的原植物（木通科植物木通A quinata，白木通A trifoliata var australis和三叶木通A trifoliata）的干燥藤茎。

2方法

21红外光谱的测定

每份药材取代表性的样品，粉碎，过6号筛（100目）；经KBr压片法制成样品片，置于红外光谱仪中，在室温下测定红外光谱图。

22二维相关红外光谱的测定

将制备的药材KBr样品片置于变温的样品架上，温度由50 ℃升高至120 ℃，每间隔10 ℃收集1张红外光谱。这些红外光谱经二维相关红外光谱软件处理得到中药样品随温度变化的二维相关红外光谱。

23红外光谱图的标准化

将收集得到的红外光谱经坐标转化（纵坐标为吸光度），基线校正，光谱归一化，得到标准图谱。识别红外光谱峰的强度阈值设为001 A。

24红外光谱相似度的评价

用相关系数表示中药红外光谱的相似度。其相关系数用投影向量夹角余弦法计算，计算公式如下。

rxy=（∑ni=1XiYi）（∑ni=1X2i）1/2（∑ni=1Y2i）1/2（1）

式中Xi和Yi表示光谱X与光谱Y在波数i处的吸光度，n为波数变量的个数[15]。

25红外光谱相关系数判别川木通真伪的域值

由于在正态曲线下区间（μ-3σ，μ+3σ）内的面积为9973%。根据正态分布的“3σ”规则，服从正态分布的随机变量和它的数学期望的偏差（绝对值）不超过它的3倍均方差的概率为0997 3。故常以Mean±3σ作为实验观测值的上控制限（UCL）和下控制限（LCL）[16]。在本研究中，以20份川木通校正集样品红外光谱的相关系数（Mean-3σ）值作为判别川木通真伪的域值。

3结果与讨论

31川木通红外光谱指纹图谱的建立

中药红外光谱可以直观地反映中药的整体成分。为了建立特征性强、评价客观的川木通红外光谱指纹图谱，在24份川木通样品中，随机抽取的4份样品（S3，S4，S8和S24）作为检验川木通真伪的验证集样品；其余20份样品（S1，S2， S5～S7，S9～S23）作为校正集样品，建立川木通的指纹图谱。首先，通过分析20份川木通校正集样品的红外光谱，找出特征峰，建立特征性指纹图谱；再计算、比较这些样品红外光谱的相关系数，确定川木通真伪鉴别的域值。

结果表明，20份川木通校正集样品的红外光谱相似（图1a），均在3 419～3 391，2935～2 918，1 741～1 736，1 655～1 636，1 509，1 463～1 453，～1 427，1 376，1 332，1 265～1 259，1 159，1 107，1 035，897，822～813，666，610～606 cm-1等处具有吸收峰。其中，3 419～3 391 cm-1为游离OH形成氢键后出现的宽而强的吸收峰；～2 923 cm-1为亚甲基CH反对称伸缩振动吸收峰；～1 739 cm-1为C=O伸缩振动吸收峰；～1 639 cm-1为OH弯曲振动吸收峰；～1 509 cm-1和～1 456 cm-1为苯环骨架伸缩振动吸收峰；～1 426，～1 376和～1 332 cm-1为CH弯曲振动吸收峰；～1 261 cm-1为COC伸缩振动吸收峰；～1 159，～1 103和～1 035 cm-1为CO伸缩振动吸收峰等。

a 20份校正集样品的重叠光谱； b 20份校正集样品产生的指纹图谱。

这20份川木通样品的整体峰形也相似。由于在4 000～2 500 cm-1的峰主要是OH和CH伸缩振动吸收峰，这一区域的红外光谱受水分的影响较大；在2 500～1 800 cm-1未发现吸收峰；在800～400 cm-1的吸收峰容易受多种因素的影响而改变位置[12]。因此，本研究选择光谱稳定、特征性强的1 800～800 cm-1的红外光谱，计算相关系数。结果表明，这20份川木通校正集样品的红外光谱很相似，与其平均光谱的相关系数为0994 3～0999 3（表1），平均值为0997 3 （n=20）。为此，将这20份川木通样品红外光谱的平均光谱作为川木通的指纹图谱（图1b），其特征峰位于3 412，2 932，1 739，1 639，1 509，1 456，1 426，1 376，1 332，1 261，1 159，1 035，897，609 cm-1等。

为了确定以红外光谱相关系数为指标判别川木通真伪的阈值，对相关系数进行了统计分析。相关系数为0～1的任意数值，可以用正态分布进行描述。根据统计学，单样本的KolmogorovSmirnov检验可判断一组观测数据的分布是否符合正态分布。为此，本研究中选用KolmogorovSmirnov检验这20份川木通样品红外光谱的相关系数的分布是否符合正态分布。结果表明，P为0088（大于005）。说明这20份川木通样本红外光谱相关系数的概率分布符合正态分布。参照正态分布曲线在数理统计中应用的“3σ”准则（Mean±3σ），以这20份川木通样品红外光谱相关系数的下限值（0992 6）为川木通真伪鉴别的指标，即待测样品与川木通红外光谱指纹图谱的相关系数大于0992 6，则判别为川木通；否则，不是川木通。

32川木通红外光谱指纹图谱真伪鉴别的检验

为了检验上述建立的川木通红外光谱指纹图谱能否鉴别川木通的真伪，本研究用4份川木通验证集样品和7份相近中药（关木通和木通）样品进行了检验。

321对川木通验证集样品的判断在收集的24份川木通药材样品中，随机抽出4份样品（S3，S4，S8，S24）作为验证样品。结果表明，这4份川木通样品的红外光谱相似（图2），共有峰位于3 412～3 392，2 935～2 925，1 737，～1 642，1 509，1 455，1 426，1 376，1 332～1 322，1 261，1 160，1 107，1 035，897，609 cm-1等。这4份川木通样品的红外光谱与上述建立的川木通指纹图谱也相似，在1 800～800 cm-1的红外光谱与指纹图谱的相关系数为0993 2～0998 2（表1），均高于0992 6。由此判断这4份样品为川木通。

322与关木通的鉴别关木通与川木通、木通的功效相近，曾称为“木通类”中药。在2000年版《中国药典》中，关木通为法定中药品种，来源于马兜铃科植物东北马兜铃的干燥藤茎。由于关木通含马兜铃酸类成分，具有致突变、致癌和肾脏毒性[78]，2003年4月被国家药品监督管理局禁用[9]。为了防止关木通混用、误用为川木通，本研究从不同产地或中药材市场收集了4份关木通样品（S25S28），测定红外光谱，并与川木通的红外光谱进行比较。结果表明，这4份关木通样品的红外光谱相似（图3），均在3 425～3 414，2 926，1 730，1 621，1 517～1 513，～1 424，1 383～1 376，1 317，1 262，1 154，1 035，895～891，781，～517 cm-1等处具有等吸收峰。但是，关木通与川木通的红外光谱不同，在具有特征性的1 800～800 cm-1，两者仅有2～4个共有峰，分别位于～1 426，1 383～1 376，～1 262，1 035 cm-1处。川木通具有1 456 cm-1峰，而在关木通中未发现；并且，川木通在1 376，1 261 cm-1处的吸收峰强于关木通。相反，关木通在～1 619，1 318，781 cm-1等处出现明显的草酸钙特征吸收峰[12]（图4），提示关木通样品中草酸钙的含量较高。光谱相似度的比较结果表明，4份关木通与川木通指纹图谱的相关系数为0902 1～0940 4（表1），均显著低于判别为川木通相关系数的域值（0992 6）。由此可见，无论从红外光谱的特征峰，还是相关系数，本研究建立的川木通红外光谱指纹图谱均能区别关木通与川木通。

323与木通的鉴别木通和川木通均为2010年版和2015年版《中国药典》中收载的2种中药，其功效相同[12]；但临床应用不同[5]，原植物的来源也不同。川木通来源于毛茛科植物小木通和绣球藤，而木通则来源于木通科植物木通、三叶木通和白木通[12]。由于这2种中药的名称相近，药材性状相似，容易混淆。为此，本研究分别收集了中药木通3种原植物的样品，测定其红外光谱，与川木通比较。结果表明，木通（S29）、白木通（S30）和三叶木通（S31）的红外光谱相似，均在3 428，2 929，1 737～1 731，1 623，1 512，1 424，1 376，1 317，1 260～1 256，1 157，1 047，895，781，663，517 cm-1等处具有吸收峰。但是，这3种植物来源的中药木通与川木通的红外光谱明显不同，在具有特征性的1 800～800 cm-1，这2种中药仅有6个共有峰，分别位于1 509，～1 456，1 426，1 376，～1 261，897 cm-1（图5）。中药川木通在～1 159，～1 107，1 035 cm-1处的3个特征峰，而中药木通（木通、白木通和三叶木通）仅出现2个峰（～1 157，1 047 cm-1）。此外，中药木通均在～1 623，1 317，781 cm-1处出现1组草酸钙的特征吸收峰[12]，而在川木通中未发现。红外光谱相似度比较的结果表明：木通、白木通和三叶木植物的红外光谱与川木通指纹图谱的相关系数为0954 9～0978 9，均小于判别为川木通的相关系数域值（0992 6）。由此可见，本研究所建立的川木通红外光谱指纹图谱能鉴别川木通和木通。

33川木通与相近药材二维相关红外光谱的比较

二维相关红外光谱可以观察样品对外界扰动的响应，获得比一维红外光谱更多的信息。随温度变化的二维相关红外光谱可获得样品中的化学成分对热稳定性及其分子结构信息[1314]。为了进一步比较川木通与相近中药的整体化学成分，本研究在一维红外光谱的基础上，比较了川木通与木通和关木通的二维相关红外光谱，评价川木通红外光谱鉴别木通和关木通的可行性。

331在850～1 150 cm-1的二维相关红外光谱川木通、木通、关木通在850～1 150 cm-1的同步二维相关红外光谱（图6），在主对角线上（v1=v2）的峰是由动态红外光谱信号自身相关而得到的自动峰，其强度反映了吸收峰对一定热微扰的敏感程度。位于非主对角线上的峰为交叉峰；当2个独立波数处的动态红外光谱信号彼此为正相关或者负相关（变化同向或反向）时出现，说明化学成分的官能团之间可能存在分子内或者分子间的作用[13]。结果表明，川木通、木通和关木通的二维相关红外光谱不同。川木通的主对角线上有4个较强的自动峰，所对应的基团振动峰分别位于887，948（最强），978（次强）和1 008 cm-1，说明这些吸收峰所对应的基团随着温度升高的变化较明显。而木通和关木通在对角线上均出现了5个较强的自动峰；木通的自动峰位于916，940，980，1 000（最强），1 147 cm-1（次强），而关木通的自动峰分别位于937，979（最强），1 068，1 086，1 139 cm-1（次强）。

332在1 150～1 500 cm-1的二维相关红外光谱川木通与木通、关木通在1 150～1 500 cm-1的同步二维相关红外光谱也不同（图7）。在川木通的主对角线上有2个较强的自动峰，分别位于1 201（最强），1 303 cm-1；自动峰之间的交叉峰为正相关。而木通对角线上有6个较强的自动峰，分别位于1 198，1 207，1 310，1 320，1 458（次强），1 472 cm-1（最强）；其中，1 320，1 458，1 472 cm-1的自动峰与其他自动峰之间的交叉峰为负相关，其余交叉峰为正相关。关木通的对角线上有3个明显的自动峰，分别位于1 192（最强），1 213（次强），1 310 cm-1；各自动峰之间的交叉峰也为正相关。由此可见，川木通与木通、关木通在850～1 500 cm-1的二维相关光谱明显不同；不仅自动峰的数目和强度不同，而且交叉峰之间的相互关系也不同，说明根据二维相关红外光谱，川木通与木通、关木通也能鉴别。

34红外光谱的稳定性

对药材红外光谱的稳定性进行了考察。用KBr制备的同一样品片，在同一仪器上连续测定6次，其相似度达0999 9以上；同一样品片，在同一仪器上连续6 d，每天测定1次，其相似度达099以上；同一份药材粉末，在3台傅里叶变换红外光谱仪上测定，其相关系数也达到099以上。表明红外光谱的稳定性强。

4结论

川木通为常用中药，且多为野生药材。虽然从不同产地、中药材市场或公司收集的川木通的大小、颜色等性状特征有差异；但是，他们的红外光谱的整体峰形、特征峰的位置及强度相似，说明这些不同来源川木通样品的化学成分相似。由这此样品计算产生的平均红外光谱反映了川木通的整体化学信息和光谱特征，且能与相近中药木通和有毒中药关木通相区别，可作为川木通的红外光谱指纹图谱。经统

1红外光谱；2自动峰；a 川木通； b 木通； c 关木通（图7同）。

计分析产生的红外光谱相关系数的域值可作为川木通真伪鉴别的量化指标。并且，红外光谱的操作简便、快速、重现性好。因此，本研究建立的川木通红外光谱指纹图谱适用于川木通的真伪鉴别，有利于保证川木通的真实性和中医药的临床疗效。

[致谢]四川大学华西药学院张浩教授，福建中医药大学杨成梓副教授，安徽中医药大学欧金梅副教授，成都中医药大学标本中心提供部分关木通和木通药材样品。

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