中药四藤方对人胃癌BGC823细胞的侵袭力及上皮钙黏附蛋白（E—cadherin）表达的影响

毛竹君 沈克平 姚琼 郑佳露 奚燕萍

摘要：目的 检测中药四藤方对人胃癌细胞株BGC823细胞上皮钙黏附蛋白（E-cadherin）蛋白表达，并观察中药对胃癌细胞侵袭力的影响。方法 实验组加入四藤方对细胞进行预处理，然后在进行培养。通过甲基噻唑基四唑法（MTT）检测细胞活性，使用划痕实验检测细胞侵袭能力变化，RT-PCR、检测E-cadherin mRNA表达的变化。结果 四藤方能抑制人胃癌BGC823细胞的增殖；抑制缺胃癌细胞的侵袭力，并且能降低E-cadherin mRNA的表达。结论 四藤方可抑制人胃癌BGC823细胞的增殖，可能通过降低E-cadherin mRNA的表达来抑制人胃癌BGC823细胞侵袭力。

关键词：中药；胃癌；BGC-823；侵袭

四藤方由红藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜四药组成，来源于我院著名肿瘤专家邱佳信教授临床验方“胃肠安方”中的小拆方，我的导师沈克平主任认为此四味中药补中有泄，抗胃癌同时不伤正气，尤其适合胃癌患者。故导师治胃癌患者以此为基础辩证与辨病相结合预防胃癌复发收效甚捷。前期研究证实四藤方具有一定抑制胃癌转移的作用，本实验进一步进行了四藤方在胃癌侵袭转移方面的作用和机制的探索。

1 资料与方法

1.1实验材料 ①中药材四藤方（红藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜）由龙华医院药材科提供，产地明确，经第二军医大学药学院生药学教研室鉴定。②主要试剂RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（PAA公司产品）；甲基噻唑基四唑（MTT）（美国Sigma公司）；BGC-823细胞购于中科院上海细胞所，细胞培养皿等耗材为Conming公司产品；Trizol为Invitrogen公司产品；反转录试剂Reverse Transeriptase M-MLV、RNase Inhibitor、Oligo d（T）18、dNTP Mixture和RealTime PCR检测试剂盒均为TaKaRa公司产品；

1.2主要仪器及设备细胞培养箱 日本（三洋；离心机、紫外分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪，均钩于美国Thermo公司；梯度PCR和RealtimePCR仪均为Ft本TaKaRa公司产品；倒置相差显微镜，日本Olympus公司产品。

1.3方法

1.3.1四藤方药物的提取 将四藤方饮片（菝葜、野葡萄藤、藤梨根等）浸泡30 min，煎煮2次，30min/次，纱布粗虑去渣，将所得滤液以5000 转离心30min以初步去掉大的颗粒杂质。取清液浓缩至300ml，加等体积的无水乙醇后置于4℃ 冰箱过夜沉淀。取出各药物与乙醇的混合液，再以5000转，30min离心，取上清液旋转蒸发回收乙醇浓缩药液，浓缩至50ml左右时取出，室内挥发24h后冷冻干燥，当药物成粉末状时取出，称重，临用时用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，0.22pure微孔滤器过滤除菌。

1.3.2实验分组和干预 实验时将细胞分为空白组、药物干预组（组加人不同浓度四藤方（1、10、100、1000、10000μg/ml），其中空白组使用不含药物的RPMI完全培养基培养，收集细胞样本进行mRNA含量检测，取处理后不同时间点细胞样本进行细胞活性检测。

1.3.3 BGC823细活性检测将对数生长期的BGC823细胞使用胰酶消化，1000转离心5min收集细胞沉淀，使用含10%FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2.5×105个/ml每孔200ul。接种于96孔板，每组设5个平行孔，正常条件培养，于第24、48、72h，各取一块培养板，每孔添加浓度为15 mg/ml的MTT，缓慢晃动培养板其在培养基均匀分布，正常条件共孵育4h，去培养液，加入DMSO150ul的溶液，于37℃温育4h，100rpm震荡10min。使用酶标仪检测波长为570nm吸光值。

1.3.4 Realtime-PCR测定E-cadherin mRNA含量 各干预组BGC823细胞培养24h，收集细胞样本，进行E-cadherin mRNA含量检测。使用Trizol法提取细胞样本的Total RNA，电泳判断总RNA的完整性，紫外分光检测RNA纯度及浓度。使用M-MLV逆转录体系及Oligo（dT）18 Primer引物逆转录制备cDNA。设计用于定量检测的PCR引物，引物序列如下：E-cadherin的上游引物序列为5'-GAACGCATTGCCACATAC-3'，下游引物序列为5'-ACCTTCCATGACAGACCC-3'。内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），其上游引物序列为5'-GACAGTCAGCCGCATClTCT-3'，下游引物序列为5'-ACATGTAAACCATGTAGTTGAGGT-3'。PCR引物设计好之后，PCR验证引物扩增效率和引物特异性，然后使用荧光染料法（SYBR）进行PCR反应。反应结束后，获得实验曲线和数据，进行数据分析。

1.3.5胃癌细胞BGC823侵袭力检测使用划痕实验 使用含10%FBS的RPMI 1640培养基各组BGC-823细胞按5×105/L接种于6孔板中，细胞生长到80%～90%时，用200μl的枪头沿着孔中央直径线做划痕，PBS洗1次，实验组加入中药四藤方（浓度为100μg/ml），为了排除增殖对迁移实验的影响，每组设3个复孔。置培养箱中继续培养24h后取出6孔板，分别在0h，24h倒置显微镜下观察划痕愈合情况。比较各组细胞细胞向划痕边缘向划痕内迁移的细胞数。

1.4统计学方法 采用方差分析（ANCOVA）及LSD两两比较法。应用SPSS15.0软件进行方差分析及总体比较；P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为有极显著性差异。

2 结果

2.1 BGC-823细胞增殖率检测 通过MTT检测可以发现，含不同药物体积的培养液均能不同程度的抑制BGC细胞的生长与增殖，且培养液内药物含量越高，培养时问越长，细胞生长受到的抑制作用也越明显，见表1。不仅与对照组相比具有统计学差异（P<0.01），而且高浓度药物组相比低浓度药物组的抑制率，也有明显统计学差异（P<0.01），见图1。提示，中药四藤方具有抑制BGC细胞生长增殖的作用。使用公式法求出四藤方提取物对于BGC823细胞的ID50：各药物浓度组的生长抑制率（%）=（1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100% ，ID50=lg-1[Xm-i（∑P-0.5）]，重复 3次取平均值，取平均值约为 7.930%。

2.2 BGC-823细胞E-cadherin mRNA表达 通过Rt-PCR检测可发现，四藤方ID50浓度干预的细胞，24h后E-cadherin mRNA的表达明显高于对照组细胞（P<0.05）。提示，四藤方具有上调BGC细胞E-cadherin基因表达的作用（P<0.05），从而抑制肿瘤细胞的黏附转移（表2，图2）。

2.3细胞侵袭力实验（划痕实验） 划痕愈合实验显示，使用四藤方ID50浓度干预24h后，侵袭力较对照组组下降，明显抑制人胃癌细胞株BGC-823的迁移，实验组划痕愈合率为（47.454～10.05）%，对照组划痕愈合率为（88.23±5.45）%（P<0.05），见图3及图4。

3 讨论

E-cadherin又被称为上皮-钙黏蛋白，定位于16号染色体长臂2区2带，含有16个外显子、15个内含子，全长约100 kb，其编码的跨膜糖蛋白相对分子质量为124×103。E-cadherin广泛分布于人类上皮细胞中，是钙依赖的黏附分子家族成员之一，可介导正常细胞间的黏附，维持正常上皮细胞形态、极性及组织结构的完整性，同时还参与细胞内信号传导[1～3]，当E-cadherin表达下降或缺失时，细胞间的相互黏附力下降，一旦获得转移的必要条件，就可脱离原发灶而发生侵袭和转移[4]。因此，E-cadherin被认为是一种抑癌基因。

本实验结果显示中药四藤方作用24h后可明显抑制人胃癌细胞株BGC-823细胞的增殖。通过划痕愈合实验，我们发现中药四藤方ID50浓度作用24h能明显抑制人胃癌细胞株BGC-823的迁移。提示四藤方在降低胃癌的侵袭力方面可能具有一定抗肿瘤的作用。为了研究四藤方降低胃癌侵袭力的作用机制，我们检测了ID50浓度的四藤方作用24h后BGC-823细胞 E-cadherin mRNA的表达量明显提高。

四藤方由红藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜四药组成，大血藤，又名“大活血”、“红藤”等，根据《中国药典》记载，大血藤气微，味苦微甘，性平，无毒，入肝、胃、心包、大肠经。具解毒消痈，活血止痛，祛风除湿，杀虫功效。其中红藤的粗提取液被发现具有很强的抗肿瘤活性[5]。野葡萄藤，《广西植物名录》：清热利湿，消肿解毒。治痢疾，疮疡肿毒。有多项实验研究发现其单独具有抗胃癌功效是专病专药[6]。藤梨根《全国中草药汇编》清热解毒，祛风除湿，利尿止血。用于风湿骨痛，以及黄疸等症。有多项实验研究发现其单独具有抑制胃癌[7]的功效，属于专病专药。菝葜见《别录》：“味甘，平温，无毒。”《品汇精要》：“散肿毒。”红藤、藤梨根清热解毒，菝葜、野葡萄藤消肿祛湿。在前期实验中我们发现示四藤方可以上调SGC -7901 胃癌Caspase -3 蛋白表达，促进PARP 蛋白剪辑，抑制Livin表达，从而促进细胞凋亡[8]。

本研究结果首次表明，中药四藤方在体外可以有效抑制人胃癌BGC-823细胞株的增殖和迁移，其机制可能是通过促进BGC-823细胞E-cadherin mRNA表达，进而发挥了抑制胃癌细胞迁移的作用。

参考文献：

[1]Hata H， Natsuga K， Kitamura S， et al.Concomitant neoplasms in skin and stomach unveil the role of type IV collagen and E-cadherin in MUC5AC expression in vivo[J].Br J Dermatol，2015，19.

[2]Jun KH， Lee JE， Kim SH， et al.Clinicopathological significance of N-cadherin and VEGF in advanced gastric cancer brain metastasis and the effects of metformin in preclinical models.[J].Oncol Rep，2015，34（4）：2047-2053.

[3]Caldeira J， Figueiredo J， Brás-Pereira C，et al.E-cadherin-defective gastric cancer cells depend on Laminin to survive and invade[J].Hum Mol Genet，2015，5. pii： ddv312.

[4].Hou X， Zhang Y， Qiao H.CCL18 promotes the invasion and migration of gastric cancer cells via ERK1/2/NF-κB signaling[J].pathway Tumour Biol，2015.

[5] 复方红藤颗粒配合化疗治疗恶性肿瘤30例临床研究。吴继萍、贝立民、松民武.中医药临床杂志.2004，16（4）： 314-316页，

[6] 何萍、沈克平、胡兵、梁云麒.四藤方对人胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响。时珍国医国药.2015，26（3）： 531-533页

[7] 郭洁、王小平、白吉庆，藤梨根提取物对人胃癌BGC细胞凋亡及Bax蛋白表达的影响.亚太传统医药.2014，10（13）： 12-13页.

[8] 何萍，沈克平，胡兵，卢艳琳.四藤方对SGC -7901 胃癌Caspase -3、剪辑型PARP 及Livin 表达影响.中华中医药学刊.2014，32（2）：247-249

编辑/安桦