冠状动脉粥样硬化患者细胞因子信号

单雪峰 陈铀 孙清超

[摘要] 目的 通过检测冠状动脉粥样硬化患者细胞因子信号转导抑制剂1（SOCS1）基因多态性的表达及外周血中相关细胞因子的含量，来探讨SOCS1与细胞因子及左心室射血分数的关系及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病发生、发展中的作用及临床意义。 方法 选择2012年1月～2014年12月新疆医科大学第一附属医院收治的冠心病患者196例为研究组，选择同期196名健康志愿者作为对照组。利用聚合酶链反应及单核苷酸多态性分析两组SOCS1基因的多态性，同时利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血浆中白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、胱抑素C（Cys-C）、同型半胱氨酸（Hcy）的水平。 结果 研究组和对照组rs15677380、rs173516427等位基因频率比较差异有统计学意义（P < 0.05），rs15677380 C等位基因和rs173516427G等位基因均为冠状动脉粥样硬化性心脏病的高危因素（OR = 1.91、1.74），rs173516427和rs15677380不同基因型左心室射血分数和IL-1β、Cys-C差异有统计学意义（P < 0.05），其中rs173516427 G/G基因型和rs15677380 C/C基因型的左心室射血分数最低，IL-1β、Cys-C水平最高。其余各组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 SOCS1与冠状动脉粥样硬化的发病过程有一定的相关性，可能参与其发病过程。

[关键词] 冠状动脉粥样硬化；细胞因子信号转导抑制剂1；细胞因子；多态性

[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（b）-0112-05

[Abstract] Objective To explore the relationship of suppressor of cytokine signaling 1 （SOCS1） with cytokines and the left ventricular ejection fraction， and the role they play in the occurrence and development of coronary heart disease by detecting the expression of SOCS1 gene polymorphism and the contents of related cytokines in peripheral blood of patients with atherosclerosis of coronary artery. Methods 196 patients with coronary heart disease admitted to the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2012 to December 2014 were chosen as the study group， 196 cases of healthy volunteers at the same time were chosen as control group. Polymerase chain reaction and single nucleotide polymorphism were used to analyze SOCS1 gene polymorphisms of two groups， ELISA method was used to test interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cystatin c （Cys-C） and homocysteine （Hcy） levels in plasma. Results There were significant differences in allele frequencies of rs15677380 and rs173516427 between study group and control group （P < 0.05）， rs15677380 C allele and rs173516427G alleles were the risk factors of coronary atherosclerotic heart disease （OR = 1.91， 1.74）. There were statistically significant differences in left ventricular ejection fraction， IL-1β and Cys-C between rs173516427 and rs15677380 （P < 0.05）， among which， the left ventricular ejection fraction of rs173516427 G/G genotype and rs15677380 C/C genotype were the lowest， whereas the IL-1β and Cys-C levels of these genotype were the highest. There were no significant differences between the other groups （P > 0.05）. Conclusion There is a certain relationship between the SOCS1 and pathogenesis of atherosclerosis of coronary artery， SOCS1 may take part in the pathogenesis of disease.

[Key words] Atherosclerosis of coronary artery； Suppressor of cytokine signaling 1； Cytokines； Polymorphism

随着人们生活水平的提高，心血管疾病的发病率和病死率逐年升高，并有年轻化和加速的趋势，已成为我国居民健康的“头号杀手”[1]，因此，对于心血管疾病的早期诊断和治疗是目前医务工作者面临的重要任务。动脉粥样硬化是引起心血管疾病的重要原因，研究提示[2]，它是一种由多因素引起的复杂的慢性炎症免疫反应过程，固有免疫与获得性免疫贯穿于动脉粥样硬化发生发展的全过程及并发症出现的各个阶段。细胞因子信号转导抑制剂1（SOCS1）是固有免疫和获得性免疫的重要生理性调节因子，能够调节淋巴细胞的激活发育和分化，并致使人γ干扰素（IFN-γ）等炎症因子的分泌减少，起到抑炎的作用[3]，通过酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路作用与T淋巴细胞、树突细胞和单核巨噬细胞，参与了动脉粥样硬化的发生发展[4]。此外，基础及临床试验研究发现[5]，炎性反应的增加，一些相关炎症因子水平的升高，如C反应蛋白、白细胞介素、肿瘤坏死因子等也参与了动脉粥样硬化的发生发展，是冠状动脉粥样硬化性心脏病的重要危险因素。本研究通过检测冠状动脉粥样硬化患者SOCS1基因多态性的表达及外周血中白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、胱抑素C（Cys-C）、同型半胱氨酸（Hcy）的含量，来探讨SOCS1与细胞因子及左心室射血分数的关系及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病发生、发展中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年1月～2014年12月在新疆医科大学第一附属医院综合心内科住院并确诊为冠心病的患者为研究组。纳入标准：①标准Judkins法行冠状动脉造影术，计算机定量分析冠状动脉狭窄程度，判断阳性标准：前降支、回旋支或右冠脉及其分支中或左主干冠状动脉直径狭窄≥50%作为冠心病的诊断标准；②无糖尿病、其他部位的严重感染、肿瘤、传染性疾病、慢性肝肾功能不全及其他自身免疫性疾病；③所有入选者均为首次就诊，就诊前未服用过他汀类药物；④所有研究对象均自愿签署知情同意书。研究组196例，其中男109例，女87例，年龄43～76岁，平均（60.1±11.6）岁。选择同期健康志愿者作为对照组。对照组共196名，其中男105名，女91名，年龄42～74岁，平均（58.4±11.2）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究取得医院伦理委员会的批准，于研究开始前与患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集 清晨空腹抽取两管静脉血，一管血液样本高温低速离心，另一管血液样本采集至EDTA抗凝采血管，-20℃冰箱储存。

1.2.2 引物的设计与合成 利用Primer Premier 5.0软件设计引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成，rs173516427上游引物序列5'-GAGAGCTT-CGACTGCCTCTT-3'，下游引物序列为5'-AGGTAGGAGGTGCGAGTYCA-3'，rs15677380上游引物序列为5'-CGCCACTTCTTCACGCTCAG-3'，下游引物序列为5'-AGGGGCCGGCTCAACACC3-3'。

1.2.3 主要试剂 5%Clelex-100（sigma公司，美国）；2×TapPCR Master Mix（上海生工生物工程有限公司）；蛋白酶K（上海生工生物工程有限公司）；IL-1β、TNF-α、Cys-C、Hcy进口分装的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.2.4 主要设备 低温高速离心机（Thermo公司，美国）；HF-2型全自动酶标仪（anthos公司，奥地利）；HH-501型水浴箱（成都可隆机械设备有限公司）；C1000型PCR扩增仪和GelDoc2000凝胶成像仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.2.5 基因组DNA的提取 采用Chelex-100法提取基因组DNA，取200 μL完全解冻并加入EDTA抗凝剂的全血，加入20 μL（20 mg/mL）蛋白酶K及150 μL（50 mg/mL）Chelex-100，用移液器反复吹打混匀。然后将EP管置于100℃水浴箱中水浴10 min，冰浴1 min，离心10 min，将上清液移至无菌EP管中，-20℃保存。

1.2.6 采用PCR法检测样本DNA PCR总反应体系为25 μL，其中DNA模板8 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Tap PCR Master Mix 12 μL，无菌去离子水补足至总体积25 μL。PCR的扩增条件：95℃ 5 min预变性后，进入主循环，总共35个循环，其中95℃变性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸60 s，末次延伸为72℃ 5 min，终止反应。

1.2.7 采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α、Cys-C、Hcy 采用ELISA法，用抗人IL-1β、TNF-α、Cys-C、Hcy的单抗包被于酶标板上，然后加入生物素化相应的抗体，最后加入终止液，在相应的波长处测OD值，通过绘制标准曲线求出标本中所测炎症因子的浓度。

1.2.8 左心室射血分数的检测 采用美国Philips iE 33彩色多普勒血流仪，由超声科主任医师在不知情的情况下对入选者进行超声心动图的检查，并利用面积长轴法测定入选者左心室射血分数的均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件分析，计数资料的比较采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOCS1基因rs173516427位点PCR-RFLP基因分型结果

SOCS1基因rs173516427位点为A/G两种基因型，PCR的扩增片段长度为249 bp，限制性内切酶酶切后A/A基因型为52 bp的片段，A/G基因型为197 bp的片段（图1）。SOCS1基因rs15677380位点为C/T两种基因型，PCR扩增片段长度为285 bp，限制性内切酶酶切后C/C基因型为91 bp的片段，C/T基因型为194 bp的片段（图2）。

2.2 两组SOCS1基因各等位基因频率的比较

研究组和对照组rs15677380、rs173516427等位基因频率比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 SOCS1基因各基因型的炎症因子与左心室射血分数的比较

对研究组2个基因型分别进行分组比较，结果显示：rs173516427和rs15677380不同基因型左心室射血分数和IL-1β、Cys-C差异有统计学意义（P < 0.05），其中rs173516427 G/G基因型和rs15677380 C/C基因型的左心室射血分数最低，IL-1β、Cys-C水平最高。其余各组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD）是冠脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起的血管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病[6]。CHD是一种多因素疾病，目前其发病机制尚未完全阐明，近年来随着研究的不断深入，发现炎症免疫反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用[7]。CHD是一种自身免疫反应介导的慢性炎症性疾病，固有免疫与获得性免疫反应存在于动脉粥样硬化发生发展及并发症出现的各个阶段[8]。

SOCS是固有免疫和获得性免疫的重要生理性调节因子[9]。这些因子通过负向调控，负反馈抑制因子调节单核巨噬细胞、树突细胞及T淋巴细胞的激活、发育和分化而参与免疫性疾病的发生和发展[10]。有关SOCS的研究多集中于SOCS1和SOCS3，国外研究者发现[11]，SOCS1的高表达可以抑制细胞因子介导的STAT的激活以及前炎症因子的基因表达和细胞的增殖，如IL-1β、IL-6、TNF-α、单核细胞趋化蛋白（MCP-1）等[12]。SOCS1是人体免疫系统的重要生理调节因子，在正常人体内呈低水平表达，经炎症细胞因子刺激后可快速诱导表达[13]。国内研究者[14]通过检测冠心病患者外周血单核细胞SOCS1的表达水平，并通过ELISA法检测患者血浆中的相关炎症因子水平发现，SOCS1在冠心病患者中的表达水平明显增高，相关炎症因子水平也相应增高，此研究结果提示SOCS1的高表达可能参与了冠心病的发生、发展，其机制可能与冠心病患者体内促炎因子水平的升高有关。Grothusen等[15]将SOCS1与低密度脂蛋白受体同时缺乏的研究组小鼠与对照组小鼠比较发现，经过高脂饮食饲养，研究组小鼠的粥样斑块面积、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的水平明显高于对照组，充分说明了SOCS1在动脉粥样硬化的形成发展中发挥着重要作用。本研究结果显示，冠心病患者SOCS1基因的rs15677380和rs173516427等位基因频率与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），与国内谷高玲等[16]的研究一致，进一步提示了SOCS1基因多态性参与了CHD的发生发展。

在CHD的发展过程中，始终有大量的炎症因子参与其中，炎症因子升高的水平与心血管事件呈显著相关。IL-1β和IL-6由多种细胞分泌，并能放大急性炎性反应，使得机体产生慢性炎症，并处于中心地位[17]。TNF-α具有广泛生物活性，并被证实存在于动脉粥样硬化的斑块中，在动脉粥样硬化的形成和炎性反应中发挥作用，参与了动脉粥样硬化的形成[18]。Cys-C是一种表达于所有有核细胞的低分子量非糖基化蛋白质，通过调节半胱氨酸蛋白酶活性，影响中性粒细胞的吞噬与趋化功能，参与炎性反应过程，升高C反应蛋白水平[19]。而炎性反应是动脉粥样硬化发生发展中的重要因素，因此Cys-C参与了动脉粥样硬化的形成，并且与斑块的消退及稳定性相关[20]。本研究发现，研究组患者SOCS1基因rs173516427和rs15677380的不同基因型左心室射血分数和IL-1β、Cys-C水平差异有统计学意义（P < 0.05），其中rs173516427 G/G基因型和rs15677380 C/C基因型的左心室射血分数最低，IL-1β、Cys-C水平最高，因此推测SOCS1可能参与CHD的发生发展，通过影响患者体内促炎因子水平及Cys-C的冠脉血管重塑，使得左心室射血分数水平降低而影响CHD的发展过程。因此，进一步推测SOCS1与CHD的发病过程有一定的相关性，通过上调体内促炎因子水平及负反馈抑制单核细胞的致炎活性，与Cys-C相互作用，影响CHD患者的左心室射血分数，进而参与CHD的发展过程。本研究结果可为动物实验和临床治疗提供一种新思路。

[参考文献]

[1] Barseghian A，Gawande D，Bajaj M. Adiponectin and vulnerable atherosclerotic plaques [J]. J Am Coll Cardiol，2011， 57（7）：761-770.

[2] Chen Z，Xu H. Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanism of tanshinone IIA for atherosclerosis [J]. Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：267976.

[3] Chen SC，Lin YI，Huang B，et al. Salvianolic acid B suppresses IFN-γ-induced JAK/STATl activation in endothelial cells [J]. Thromb Res，2011，128（6）：560-564.

[4] Kadowaki T，Yamauchi T，Okada-Iwabu M，et al. Adiponectin and its receptors：implica-tions for obesity-associated diseases and longevity [J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2014， 2（1）：8-9.

[5] Sprague AH，Khalil RA. Inflammatory cytokines in vascular dysfunction and vascular disease [J]. Biochem Pharmacol，2009，78（6）：539-552.

[6] Hansson GK. Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease [J]. N Engl Med，2005，352（16）：1685-1695.

[7] Song X，Zhang Z，Wang S，et al. A Janus Kinase in the JAK/STAT signaling path-way from Litopenaeus vannamei is involved in antiviral immunity response [J]. Fish Shellfish Immunol，2015，44（2）：662-673.

[8] Legein B，Temmerman L，Biessen EAL，et al. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis [J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2013，70（20）：3847-3869.

[9] Sygitowicz G，Janas J，Bialek S，et al. Ischaemia modified albumin in patients with acute coronary syndrome and negative cardiac troponin Ⅰ [J]. Scand J Clin Lab Invest，2013，73（2）：130-134.

[10] Kaptoge S，Seshasai SR，Gao P，et al. Inflammatory cytokines and risk of coronary heart disease：new prospective study and updated meta-analysis [J]. Eur Heart J，2014，35（9）：578-589.

[11] Linossi EM，Babon JJ，Hilton DJ，et al. Suppression of cytokine signaling：the SOCS perspective [J]. Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（3）：241-248.

[12] Recio C，Oguiza A，Mallavia B，et al. Gene delivery of suppressors of cytokine signaling（SOCS）inhibits inflammation and atherosclerosis development in mice [J]. Basic Res Cardiol，2015，110（2）：8.

[13] Tran-Thanh D，Arneson NC，Pintilie M，et al. Amplification of the prolactin receptor gene in mammary lobular neoplasia [J]. Breast Cancer Res-Treat，2011，128（1）：31-40.

[14] 向水，董念国，刘金平，等.SOCS1/SOCS3在冠心病患者外周血单个核细胞中的表达及意义[J].华中科技大学学报：医学版，2012，41（2）：152-155.

[15] Grothusen C，Schuett H，Hillmer A，et al. Role of suppressor of cytokine signaling-1 in murine atherosclerosis [J]. PloS One，2012，7（12）：e51608.

[16] 谷高玲，赵国安，孙海燕，等.冠心病患者细胞因子信号转导抑制剂1基因多态性的临床意义[J].中国医科大学学报，2013，42（5）：436-450.

[17] Nizamutdinova IT，Kim YM，Jin H，et al. Tanshinone IIA in- hibits TNF-α mediated induction of VCAM-1 but not ICAM-1 through the regulation of GATA-6 and IRF-1 [J]. Int Immunop-harmacol，2012，14（4）：650-657.

[18] 李广平，李大勇.动脉硬化闭塞症中医证候与血清hsCRP、TNF-α表达的研究[J].中华中医药学刊，2013，31（8）：1619-1620.

[19] 周月涛，张爱华.血清胱抑素C水平与冠状动脉粥样硬化病变严重程度的相关性研究[J].疑难病杂志，2011， 10（12）：929.

[20] 刘海燕，杨文东.血清同型半胱氨酸和胱抑素C水平与冠状动脉病变严重程度的相关性[J].检验医学与临床，2012，9（11）：1328.

（收稿日期：2015-12-09 本文编辑：张瑜杰）