健脾益气通络复方对早期糖尿病肾病大鼠血清脂联素与血清超敏C—反应蛋白影响的实验研究

李琼锋　韦衮政　李黔云

摘要：目的 通过观察健脾益气通络复方对早期糖尿病肾病（DN）大鼠血清脂联素（ADPN）与血清超敏C-反应蛋白（hs-CRP）表达的影响，以探讨健脾益气通络复方防治早期糖尿病肾病的效果及其作用机制。方法 将实验用大鼠分为正常对照组、模型空白组（高糖高脂饲料 + STZ）、中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组及阳性西药对照组，采用高糖高脂饲料喂养结合一次尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）的造模方法，复制出糖尿病肾病模型，各药物组干预4周后，将大鼠处死取血，用ELISA方法测试各组血清hs-CRP 与血清 ADPN 的表达情况，最后进行组间比较。结果 模型空白组大鼠的血清 hs-CRP含量比正常组明显上升（P<001），其它各组经药物干预后，均可以显著降低其表达水平（P<001），但以中药预防组效果最佳；模型空白组大鼠的血清ADPN比正常组明显下降（P<001），其它各组经药物干预后，均可以显著升高其表达水平（P<001），以中药低剂量组效果最佳。结论 DN的发病机制可能与血清hs-CRP 和血清ADPN 的表达异常密切相关；健脾益气通络复方防治 DN发生发展的药理机制可能是通过调节血清 hs-CRP 和血清 ADPN的异常表达来实现。

关键词：糖尿病肾病；健脾益气通络复方；血清脂联素；血清超敏C-反应蛋白

中图分类号：R2855 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2016）08-0078-03

糖尿病肾病（DN）又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病（DM）最常见、最严重的慢性微血管并发症之一，是慢性肾衰最常见的病因及DM患者死亡的主要原因。hs-CRP 是一种敏感的非特异性的临床上最有效的炎症标志物，其本身也参与炎症过程。脂联素是一种内源性生物活性蛋白质，是一种胰岛素增敏激素，近年来发现其血浆水平的降低是发生胰岛素抵抗和糖尿病的独立危险因素。本文旨在探讨健脾益气通络复方对早期DN大鼠血清hs-CRP和血清ADPN表达的影响，深入分析中医药防治DN的药理作用机制，从深层次探讨早期DN的发病机制。

1 材料

11 药物与试剂 链脲佐菌素（STZ，美国 Sigma 公司）；健脾益气通络复方由黄芪30 g，党参20 g，白术20 g，茯苓20 g，丹参20、泽兰20g，水蛭6 g组成，用免煎中药配方颗粒（江阴天江有限公司）；西药选用洛汀新（即盐酸苯那普利片，10mg/片，由北京诺华制药有限公司制造）。血清超敏 C—反应蛋白 ELISA 试剂盒、血清脂联素ELISA试剂盒（美国 R&D 公司）。

12 实验动物及分组 选择雄性健康SD大鼠60只，体重180-220 g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司。随机分为6组：A组-正常对照组、 B组-模型空白组（高脂高糖饲料 + STZ）、 C组-中药预防组、D1 组-中药低剂量组、D2 组-中药高剂量组及E组-阳性西药对照组。

13 主要仪器及设备 血糖仪及试纸（德国罗氏诊断公司）；加样器（Eppendorf 公司）；酶标仪洗板机、微孔板酶标仪（美国伯乐公司）；电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；超低温冰箱（日本三洋机电株式会社）。

2 方 法

21 DN模型的制备及成功标准 采用高糖高脂饲料喂养加STZ一次尾静脉注射法诱导大鼠早期 DN模型。除正常对照组外，其他各组均给予高糖高脂饲料（615%普通饲料、20%蔗糖、 10%猪油、25%胆固醇、5%蛋黄粉、 10% 胆酸盐）。喂养1个月。禁食12h后，高糖高脂喂养的大鼠均以40mg/kg 的链脲佐菌素（STZ）一次尾静脉注射[注射前用01mol/L无菌枸橼酸缓冲液（pH42）配制]。72h后，尾静脉取血测量血糖值，以空腹血糖≥167mmol/L，列入观察对象。1周后，收集高血糖大鼠24h尿液，测量尿微量白蛋白值（云南中医学院附属医院检验科检测），将检测结果高于正常值范围的大鼠纳入正式实验中。

22 药物的干预方法 A、B组给生理盐水2mL；中药颗粒剂溶于蒸馏水中，C、E 组大鼠每日用药量按人体（g/kg）的63倍计算；D1组为C组的 1/3 用药量；D2组为 C 组的3倍用药量。预防组在血糖达标后即给予中药复方。DN模型复制成功后，D1、D2 及E组开始给药。灌胃，每日1次，给药疗程共4周。

23 标本采集及测定 给药疗程结束后，大鼠禁食、自由饮水24h后，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3mL/kg体重）。开腹，腹主动脉采血，不抗凝，低温静置2h后3000 r/min离心10min，收集血清，以备用ELISA法检测。ELISA法测定血清hs-CRP 和血清脂联素的过程严格按照试剂盒的要求进行。

24 统计学处理 数据分析用SPSS 115统计软件，计量资料组间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVE），P

3 结果

31 对血清超敏C-反应蛋白表达的影响 见表1，图 1。

从上表的统计结果分析可见，A组的血清脂联素含量与各组均有显著性差异（P<001）；B组的含量明显下降，且与各组间存在着明显的差异（P<001）；经药物干预治疗后，各组血清脂联素水平均呈现上升趋势，且与B组均有显著性差异（P<001），并与A组也存在着显著性差异（P<001）；在各药物干预组中，D1组的上升趋势明显，与各药物干预组存在着显著性的差异（P<001）。由此可见，血清脂联素的含量在DN的发生发展过程中明显下降，各组经药物干预后，其含量均呈现明显的上升趋势，但以D1组的干预效果最佳，提示低剂量的中药复方对升高血清脂联素的含量效果最好。

4 讨论

糖尿病肾病（DN）是糖尿病全身性微血管病变主要表现之一，是一种以血管损伤为主的肾小球病变。DN早期只是出现间歇性蛋白尿或微量蛋白尿，随着病情的逐渐加重而出现持续蛋白尿、 高血压、水肿等，晚期出现肾功能衰竭，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病早期的肾脏功能损伤主要是微量蛋白尿的出现，是反应肾小球受损的最敏感的指标，在肾功能损伤后尚可逆转时发出的警告，因而尿微量白蛋白的测定能够指导临床及时治疗[1]。本实验在使用一次性尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）一周后，收集大鼠24h尿液，测量尿微量白蛋白的变化，予出现高于正常值范围的大鼠纳入到实验中，认为大鼠已经开始出现肾脏损伤。

糖尿病肾病（DN），属中医“消渴”、“虚劳”、“水肿”等病范畴。目前中医治疗DN，“多从肾论治”。笔者认为脾为后天之本，气血生化之源，有升清、散精和固摄精气的作用。正如《素问经脉别论》曰：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通条水道，下输膀胱，水精四布，五经并行”。糖尿病的主要诊断依据是血糖升高超过标准，而血糖主要来源于脾胃受纳的水谷精微。精微积聚当责之脾失运化。胰岛素绝对或相对不足，相对于中医为脾运化水谷精微功能不足，脾“为胃行其津液”的物质基础匮乏和功能失调，其病机关键为脾虚。脾虚固摄无力导致精微物质流失出现蛋白尿。“脾虚”，气血生化乏源，气虚则动血无力，血运不畅；血弱则脉络充盈欠佳，血流缓慢，血液中致病物质沉积于脉络，则脉络狭窄，二者均导致瘀血而成瘀证。“消渴”病若控制不佳，随病情发展波及肾，随着肾受损逐渐加重，固摄无权，加重精微物质持续下注，蛋白尿流失加重。因此，糖尿病肾病的发生发展，总以“脾伤”、“脾虚”为始动环节，即早期糖尿病肾病以脾气虚弱，瘀血阻络为基本病机，日久脾病传肾。故本实验采用健脾益气通络中药复方来进行干预，并取得了明显的效果。

hs-CRP是一种血清球蛋白，由肝细胞合成，是全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，其本身也参与炎症过程，是区分低水平炎症状态的灵敏指标。血清 hs-CRP 能通过影响内皮细胞，致内皮功能受损，使微血管病变加速动脉硬化进展。在糖尿病微血管并发症超敏CRP致DN的可能发病机制为慢性炎症，慢性炎症可能通过造成肾血管内皮细胞和系膜细胞的损害等多种途径使肾脏损伤[2-4]：炎症反应可引起机体的氧化应急，使低密度脂蛋白氧化为 OX-LDL，后者可直接损害肾小球内皮细胞，增强单核细胞对血管内皮的黏附和浸润，炎症反应还可促进糖化和脂化终末产物修饰血管蛋白，引起管壁增厚、弹性下降，促进动脉硬化的发生、发展。Navarra 等[5]发现尿蛋白与血液中高敏hs-CRP呈正相关。本实验研究结果表明，DN大鼠的血清hs-CRP显著升高，经药物干预后，其含量呈现下降趋势，且与模型组均有显著性差异（P

脂联素是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，具有降低餐后血清游离脂肪酸和增强肝细胞对胰岛素的敏感性而抑制肝葡萄糖输出[6]，还可抑制TNF-α通路增强胰岛素PI-3K通路，增强胰岛素的敏感性[7]。脂联素可抑制单核细胞系的增殖和成熟巨噬细胞的功能，是一种重要的负性调节物质，可通过其抑制作用来终止炎症的发生发展过程[8]。本实验的研究结果显示，DN大鼠的血清脂联素表达水平明显下降，与其他各组有显著性差异（P<001）；经各药物组干预后，血清脂联素含量均有上升，但以低剂量组的效果最佳，提示低剂量的中药复方对血清脂联素的含量表达影响最好。

综合本实验的研究结果分析，DN的发病机制与血清 hs-CRP和血清脂联素的异常表达密切相关，血清 hs -CRP在DN大鼠明显升高，血清脂联素在 DN大鼠明显下降，脂联素可以有效降低血清hs-CRP的异常表达，提示其参与了终止炎症发生发展的过程。健脾益气通络复方对DN的发生发展有明显的防治作用，其药理机制可能是通过调节血清hs-CRP和血清ADPN的异常表达来实现。在本实验中，提示不同剂量的中药复方对于不同指标的影响效果存在着一定的差异，为今后的中药剂量研究提供了一定的依据。

参考文献：

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[2]刘丽楠，程晨，张红糖尿病肾病与脂联素、超敏C-反应蛋白相关研究[J].武警总医院学报，2008，17（6）：501-502

[3]任冬梅血清 Cys-C、CRP、IL-6 检测对早期糖尿病肾病的诊断意义[J].中华保健医学杂志，2011，13（1）：48-49

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（收稿日期：2016-06-10）