小花棘豆中毒对和田羊内脏器官α—甘露糖苷酶的影响

王帅　廖秋萍　贾琦珍　陈根元

摘要：探讨小花棘豆（Oxytropis glabraD C）中毒对和田羊内脏器官α-甘露糖苷酶（AMA）的影响，进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将12只和田羊随机分为3组，即对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组分别按10g/kg和20g/kg的剂量饲喂小花棘豆，饲喂至出现典型中毒症状。屠宰后每组随机采集试验羊的肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏，检测和田羊内脏器官AMA活性及表达的变化。结果表明，和田羊肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏中高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMA1）和溶酶体α-甘露糖苷酶（AMA2）均有表达。试验I组和田羊各器官的AMA2的表达均与对照组差异不显著（P>0.05），试验Ⅱ组和田羊肝脏和肾脏AMA2的表达显著低于对照（P<0.05），但其余器官AMA2的表达均与对照组差异不显著（P>0.05）；试验lI组和田羊肝脏和肾脏AMA1的表达极显著低于对照（P<0.01），脾脏AMAl的表达显著低于对照（P<0.05）；试验Ⅰ组和田羊肝脏、肾脏AMA1的表达显著低于对照（P<0.05），其余器官AMAl的表达均与对照组差异不显著（P>0.05）。不同剂量小花棘豆均可降低和田羊内脏中AMA活性及其mRNA表达量，肝脏和肾脏是其主要作用的靶区。

关键词：小花棘豆（Oxytropis glabra DC）；苦马豆素；α-甘露糖苷酶；内脏器官

中图分类号：S856.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2308-05

小花棘豆（Oxytropis glabra DC）是广泛分布于新疆天然草原的有毒植物之一，具有耐旱、耐贫瘠、返青早、生命力强、繁殖系数高等特性。是制约新疆草原畜牧业发展的重要因素。目前仅南疆阿克苏、和田地区天然草场中广泛丛生小花棘豆的面积已超过20%，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜总数的5%-10%，其中50%左右的中毒家畜死亡。中毒家畜表现为机体的广泛性损伤，剖检发现其内脏器官多出现肿胀等炎症，病理组织学表现主要为细胞空泡变性。国内外研究发现，苦马豆素（Swainsonine，SW）是小花棘豆的主要毒性成分，可通过抑制α-甘露糖苷酶（oL-Mannosidase，AMA）活性，导致机体甘露糖代谢发生异常而发挥毒性作用。研究表明，AMA是动物小花棘豆中毒特异性最强的指标，小花棘豆中毒动物的AMA活性受到显著抑制，但对其转录、翻译、加工修饰等的影响尚不清楚。和田羊是新疆南疆地区的主要放牧品种，占该地区绵羊存栏数的70.97%，在畜牧业生产中占有重要地位。近年来，和田羊小花棘豆中毒已成为该地区畜牧业发展面临的严重问题。本试验通过ELISA、免疫组化和荧光实时定量PCR。以新疆南疆地区小花棘豆为试验材料，研究小花棘豆攻毒对和田羊内脏器官AMA活性及分布、表达的影响。为揭示小花棘豆中毒机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康和田羊12只，雌雄各半，体重（32±1.4）kg，购自同一牧场。小花棘豆风干样采自阿克苏市温宿县佳木乡，由塔里木大学动物科学学院草业科学学科组鉴定。

S-P超敏组化试剂盒（福州迈新生物技术公司）；AMA检测试剂盒（南京建成生物技术公司）：反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒、Real-time PCR试剂盒，均购自TAKARA（大连）有限公司。

1.2 试验动物分组与处理

试验羊随机分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。每组4只。对照羊自由采食青干草。每只每日补饲精料300g，试验Ⅰ、Ⅱ组饲喂小花棘豆粉，每天分别按10g/kg和20g/kg的剂量与300g精料加水混匀，饲喂3次，即08：00-09：00、14：00M5：00、19：00-20：00，自由采食后饲喂青干草。自由饮水。待出现喜卧、起立困难、以手提耳出现摇头等典型中毒症状后进行屠宰，分别取肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏组织，部分进行免疫组化染色分析，部分利用冰生理盐水制备10%组织匀浆液用于检测AMA活性，部分液氮保存用于检测mRNA水平表达的影响。所有解剖工具及冻存管均需用DEPC预处理。

1.3 AMA在中毒羊内脏器官组织的分布

和田羊内脏器官组织均使用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋。包埋组织进行连续切片，片厚6μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，然后按照试剂盒说明操作。其中抗体稀释比为1/100，DAB显色。使用PBS为阴性对照。常规脱水，透明，封片，光镜下观察组织病理学变化。采用hnage-ProPlus6.0软件对免疫组化获得照片进行分析。

1.4 AMA活性测定

按照试剂盒说明书，采用间接ELISA法测定和田羊内脏器官组织中AMA活性。具体步骤为：标准品稀释→加样→温育→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定。

1.5 AMA表达水平的测定

1.5.1 引物设计与合成

根据GenBank中绵羊高

尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMAl）、溶酶体α-甘露糖苷酶（AMA2）和Bβ-actin基因的核苷酸序列，采用BeaconDesigner软件设计引物，引物见表1，由TAKARA（大连）有限公司合成。

1.5.2 总RNA提取与cDNA合成 参照TAKARA总RNA提取试剂盒（D9108）说明书提取绵羊待测组织总RNA，通过检测OD_260nm和琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，将合格RNA利用gDNAEraser去除基因组DNA，反应条件：42℃，2min。然后采用两步法进行反转录。反应体系：PrimeScriptBuffer5x4.0μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μL，RTPrimerMix1.0μL，RNA提取液10.0μL，RNaseFreedH₂O4.0μL：反应条件：37℃反应15min，85℃反应5s，-20℃保存。

1.5.3 普通PCR及基因测序 PCR反应体系：2xTaq PCR Master Mix12.5μL，模板cDNA2.0μL，上、下游引物各2.0μL，ddH₂O6.5μL；各反应程序为：95℃预变性5min：94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环：72℃延伸10min。PCR产物送至TAKARA（大连）有限公司测序。

1.5.4实时荧光定量PCR检测和田羊内脏器官中AMA的相对表达 实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq 2×10，0μL，上、下游引物各0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ50×0.4μL，cDNA液2.0μL，RNaseFreeddH₂O6，0μL；反应条件：95℃预变性30s：95%变性5s，60℃退火34s，72℃延伸30s。40个循环：72℃延伸10min。按反应体系及条件进行实时荧光定量PCR，得到各部分Ct值，采用双标准曲线法对所得实时荧光定量PCR结果进行分析。

1.6 数据分析

数据用SPSS16.0软件进行分析，通过One-WayANOVA方法分析单因素方差，结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 AMA在和田羊内脏器官组织中的分布

由图1可知，AMA在和田羊的肝脏组织、肾脏皮质区、肾脏髓质区、脾脏红髓、脾脏白髓、脾脏小梁、心肌组织、肺泡组织等区域均有分布。但在肝脏中央静脉、小叶间静脉、小叶间动脉、肾小球细胞和肾小管细胞中染色极淡，表明在这些区域AMA表达较弱或不表达。小花棘豆攻毒羊肝细胞、肾脏皮质区和髓质区细胞、脾脏红髓、脾脏小梁中AMA的染色明显变淡。其中试验Ⅱ组和田羊肝细胞、肾脏皮质区和髓质区细胞中AMA免疫组化染色极淡，表明这些区域AMA已经几乎不表达。

2.2 引物的可靠性验证

由图2可知，β-actin在100bp左右出现条带，AMA1和AMA2基因分别在100bp和200bp间出现2条清晰条带，与试验设计的目的条带大小相符，表明引物设计良好。

2.3 和田羊内脏器官AMA活性的变化

由表2可知，试验组和田羊内脏器官AMA活性与对照组相比均有一定程度的下降，其中试验Ⅰ组和田羊脾脏、心脏和肺脏与试验Ⅱ组和田羊心脏、肺脏AMA活性均显著低于对照（P<0.05），试验Ⅰ组和田羊肝脏、肾脏和试验Ⅱ组和田羊肝脏、肾脏和脾脏AMA活性均极显著低于对照（P<0.01）。试验表明，长时间、大剂量的摄食小花棘豆可显著影响和田羊内脏器官AMA活性，其中小花棘豆中毒对肝脏和肾脏的影响最为明显。

2.4 和田羊小花棘豆中毒对内脏器官AMA1在mRNA表达水平的影响

由表3可知，试验组和田羊内脏器官中AMA1均有表达。与对照组相比。试验Ⅰ组和田羊肝脏、肾脏与试验Ⅱ组和田羊脾脏AMA1mRNA表达量显著低于对照（P<0.05）：试验Ⅱ组和田羊肝脏与肾脏中AMA1mRNA表达量均极显著低于对照（P<0.01）。其余指标均与对照组差异不显著（P>0.05）。试验结果表明，大剂量、长时间的饲喂小花棘豆可显著影响和田羊肝脏、肾脏和脾脏的AMA1在mR-NA的表达水平。

2.5 和田羊小花棘豆中毒对内脏器官AMA2在mRNA水平表达的影响

由表4可知，通过小花棘豆的攻毒饲喂，各试验组和田羊内脏器官AMA2mRNA表达量均有不同程度的下降，其中试验Ⅱ组和田羊肝脏与肾脏中AMA2mRNA表达量均显著低于对照（P<0.05），但其余脏器指标均与对照组差异不显著（P>0.05）。试验表明，小花棘豆中毒对和田羊内脏器官AMA1mRNA表达量的影响较为显著，对AMA2mRNA表达量的影响不明显。

2.6 和田羊小花棘豆中毒对脏器中AMA基因序列的影响

经DNAStar软件分析及NCBIBlast比对，试验Ⅰ组和田羊肺脏和心脏AMA与公布的基因序列完全一致，脾脏AMA与公布的基因序列重合率大于99%，表明低剂量小花棘豆中毒对和田羊肺脏、心脏及脾脏AMA的表达均无显著影响。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组和田羊肝脏、肾脏AMA与公布的基因序列有较大差异，其中试验Ⅰ组和试验Ⅱ组和田羊肝脏AMA1与公布的基因序列重合率分别只有93%和90%，肾脏AMA1与公布的基因序列重合率分别只有93%和91%，但各试验组和田羊AMA2与公布的基因序列重合率均在95%以上，表明小花棘豆中毒对和田羊内脏器官中AMA1有显著影响。

3 讨论

小花棘豆化学成分组成复杂，国内外研究发现小花棘豆含有生物碱、皂苷、黄酮、挥发油、酚类、有毒蛋白等多种活性物质，其中吲哚里西啶类生物碱苦马豆素被多数研究者确认为小花棘豆的主要毒性成分。目前研究认为，苦马豆素阳离子呈半椅状结构，而甘露糖苷在酶水解的过程中其阳离子也形成了半椅状的立体构型，二者极为类似，故苦马豆素对AMA具有极高的亲和性：另据化学分析表明。苦马豆素的吲哚里西啶环上结合有3个羟基，其中的顺式二醇官能团和对位的羟基可增加苦马豆素同甘露糖阳离子的相似性，分子间的氢键又增加了苦马豆素与AMA结合的特异性，并在其糖基化修饰甘露糖低聚糖的过程中发挥作用，造成甘露糖代谢障碍，最终因低聚糖大量蓄积而导致动物细胞损伤。贾琦珍等研究表明小花棘豆中毒可导致动物脏器损伤，而且肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数与小花棘豆中毒均极显著相关（P<0.01）。心脏指数与肺脏指数与小花棘豆中毒均显著相关（P<0.05）。丁伯良等研究认为甘肃棘豆（主要毒性成分为苦马豆素）中毒山羊组织细胞的空泡变性与AMA活性下降有关，本试验发现AMA在和田羊内脏器官组织中均有分布，小花棘豆中毒和田羊内脏器官中AMA活性显著下降，而且与时间一剂量呈正相关。表明苦马豆索可通过影响AMA导致动物中毒。

在哺乳动物细胞组织中存在3种结构形式不同的AMA，其主要在糖基化修饰低聚糖过程中发挥重要作用，是N-聚糖成熟和降解的必要酶，也可在N-糖基化过程中加工甘露糖。不同的AMA可降解各类糖蛋白中的低聚糖苷，从而影响蛋白的折叠、成熟等过程，苦马豆素与甘露糖竞争性结合AMA可导致糖蛋白构象及生物活性改变，中毒动物出现溶酶体蓄积病的典型症状，Douglas等研究发现苦马豆素可显著影响AMA的表达，并认为苦马豆素对AMA的抑制不仅是因为空间结构的相似，还因为弱碱性的苦马豆素极易与酸性的AMA结合。贾琦珍等研究表明苦马豆索可显著抑制AMA在家兔脑组织中的表达，长时间、高剂量的摄入苦马豆索可极显著抑制AMA1在家兔小脑、丘脑和大脑组织中的mRNA表达量。本试验研究发现，小花棘豆毒性成分SW可影响和田羊内脏器官中AMA1和AMA2在mRNA水平的表达，而且其对AMA1的影响较为显著。该结果与荣杰、宋岩岩、张建军等的研究结果一致。另外免疫组化试验发现小花棘豆中毒和田羊内脏器官中AMA蛋白表达均有一定程度的下降，而且高剂量小花棘豆攻毒可导致和田羊内脏器官AMA蛋白表达受到显著抑制。中、高剂量苦马豆素均可显著降低中毒绵羊肝脏、肾脏AMA1基因序列与公布的基因序列的重合率，高剂量组攻毒绵羊肝脏AMA1基因序列与NCBI公布的序列重合率仅有90%，表明绵羊小花棘豆中毒可显著影响AMA1mRNA表达水平、蛋白表达水平和基因序列组成。

Doudas等研究发现苦马豆素是AMA1的高效抑制剂，而且这种抑制作用极为专一：对AMA2、β-甘露糖苷酶等不能完全抑制。本研究结果与之一致。苦马豆素的弱碱性质及其空间结构特性，使A-MA1与苦马豆素极易结合，导致蛋白合成异常，出现天冬酰胺-糖蛋白聚合体。不同的动物、中毒组织及攻毒植物可导致不同的低聚糖组成，中毒绵羊的肝、肾组织中低聚糖主要为甘露糖-葡萄糖-N-乙酰基葡萄糖，中毒动物细胞内大量蓄积低聚糖可造成组织、器官等损伤及发生功能性障碍。其中神经系统损害出现最早，其损伤为不可逆并多伴有神经细胞损伤：生殖系统损伤出现较晚。但影响最为广泛，并可透过胎盘屏障影响胎儿健康，肝脏是动物最重要的解毒器官，肾脏是动物重要的排泄器官。但苦马豆素对动物肝脏、肾脏影响的微观机制研究较少。本试验研究了苦马豆素对绵羊肝脏、肾脏AMA活性、mRNA表达水平、蛋白表达水平和基因序列组成的影响，为动物小花棘豆中毒机制的研究提供了一定的基础。

4 结论

小花棘豆中毒可导致和田羊内脏器官AMA活性与表达水平显著下降，而且下降趋势与小花棘豆摄入量呈显著正相关。小花棘豆中毒对肝脏、肾脏AMA1的影响较为显著，其可通过mRNA水平和蛋白表达水平影响AMA1在肝脏和肾脏中的作用。