调节性T细胞对LPS诱导的小鼠早产模型胎盘炎症反应的影响

王　凡, 林晓洁, 肖　谧, 陈茹娟, Muhammad Siddiq, 刘　俐

(西安交通大学医学院第一附属医院 新生儿科, 陕西 西安, 710061)



调节性T细胞对LPS诱导的小鼠早产模型胎盘炎症反应的影响

王凡, 林晓洁, 肖谧, 陈茹娟, Muhammad Siddiq, 刘俐

(西安交通大学医学院第一附属医院 新生儿科, 陕西 西安, 710061)

摘要:目的研究调节性T细胞对脂多糖(LPS)诱导的小鼠早产模型胎盘炎症反应的影响。方法孕17 d小鼠分组为腹腔注射PBS组(Control组)，腹腔注射LPS(LPS组)，腹腔注射LPS并尾静脉注射PBS组(LPS+PBS组)，腹腔注射LPS并尾静脉注射Treg组(LPS+Treg组)。构建LPS腹腔注射诱导的17 d孕小鼠早产模型。在第2剂LPS注射后1、6、12 h及出生时留取胎盘组织，检测Treg细胞标志物叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)、白血病抑制因子(LIF)、血红素加氧酶-1(HO-1)和白介素 6(IL-6) mRNA及蛋白表达水平。结果① LPS组早产率100%，Control组未发生早产，LPS+Treg组早产率与LPS组和LPS+PBS组差异无统计学意义(P>0.05)。② LPS组与LPS+PBS组胎盘组织中Foxp3、HO-1、LIF在第二剂LPS注射后1、6、12 h及出生时表达显著下降，IL-6表达显著增高；LPS+Treg组Foxp3、HO-1、LIF表达明显增高，IL-6表达显著降低。结论在LPS腹腔注射诱导的早产小鼠模型中，胎盘组织Treg减少可能是早产的机制之一，HO-1、LIF参与了Treg在母胎界面维持的独特的免疫微环境；Treg过继治疗可通过降低IL-6的表达减轻胎盘组织炎症反应。

关键词:叉头翼状螺旋转录因子; 脂多糖; 早产; 胎盘; 小鼠模型

感染是早产的主要原因，它可以激活孕母及胎儿的炎症反应[1]。胎儿作为一种半同种异体移植物植入母体并不被母体免疫系统排斥，其中妊娠的免疫耐受机制起重要作用。调节性T细胞(Treg)在母胎界面介导一个特殊的免疫微环境，使母体的免疫系统对胎儿产生免疫耐受，维持胎儿正常生长，母胎界面Treg细胞减少是早产的机制之一[2-3]。Treg细胞发育及功能失调，与多种重大免疫相关性疾病有关[4]，其中叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)为CD4+CD25+Treg细胞的特异性标志，在Treg细胞发育和功能维持中起着重要作用[5-6]。孕母Treg细胞不仅被证明与流产和早产密切相关，而且动物实验已经证明在胚胎着床期，即孕0～4 d，孕鼠注射Treg细胞可以完全阻止早产的发生[7]。虽然Treg细胞在自发性早产发生中的角色已被证实，但Treg细胞在孕晚期宫内感染诱导早产中的作用机制仍不明确，对其作用机制的研究将为预防或治疗宫内感染相关早产提供新的靶点。本研究拟以脂多糖(LPS)腹腔注射17 d孕鼠为研究对象，构建宫内感染诱导早产模型，并选孕14 d小鼠脾脏Treg细胞，尾静脉注射，探讨宫内感染17 d孕鼠胎盘组织Treg细胞以其相关因子在Treg细胞治疗前后的变化。

1材料与方法

1.1研究对象及分组

1.1.1模型构建: ① 小鼠来源：清洁级Balb/C雌鼠，体质量20～25 g，C57雄鼠，体质量25～30 g，8～10周，购自西安交通大学医学院动物实验中心，每日日照12 h。以雌∶雄=2∶1合笼饲养，每日晨8：00检查雌鼠阴道情况，如见到明显阴道栓，则可确认受孕，见栓当日计为孕0 d。② 动物分组：每15只孕鼠随机分为一组，共4组，即腹腔注射PBS组(Control组)，腹腔注射LPS(LPS组)，腹腔注射LPS+尾静脉注射PBS组(LPS+PBS组)，腹腔注射LPS+尾静脉注射Treg组(LPS+Treg组)。在注射第2剂LPS后1、6、12 h及出生时留取胎盘组织。前3个时间点各3只孕鼠，出生时各6只孕鼠。③ LPS诱导宫内感染早产模型的构建：雌鼠孕龄17 d时，分别于下午2时和5时腹腔注射LPS(LPS，E．coli，serotype 055：B5；Sigma)，剂量50 μg/kg。

1.1.2Treg细胞磁珠分选：从14 d相同种系正常孕鼠脾脏提取单细胞悬液，利用CD4+CD25+Foxp3 Treg磁珠分选试剂盒(购自德国美天旎公司)进行Treg 细胞的分选，取分选后的Treg细胞用CD4-FITC(购自德国美天旎公司)进行标记，流式细胞仪检测分选后的Treg细胞浓度大于90%。以2×105/200 μL PBS个Treg 细胞对小鼠尾静脉注射。

1.2方法

1.2.1小鼠实验标本的釆集：孕鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，打开腹腔，分离每个胎盘，将分离的完整胎盘组织放入预先盛有预冷无菌生理盐水的培养皿清洗3遍，标记后迅速放入液氮，2 d后转入-80 ℃低温冰箱，Western blot和RT-PCR备用。

1.2.2RT-PCR检测胎盘组织Foxp3、血红素加氧酶(HO-1)、白血病抑制因子(LIF)、IL-6 mRNA的表达情况：胎盘从-80 ℃冰箱中取出，称重25～30 mg组织，放入无菌无酶的一次性匀浆器中匀浆。按照Tissue RNA Prep kit(OMEGA 美国)和PrimeScriptTMRT MasterMix(TaKaRa 日本)操作说明抽提和逆转录RNA。紫外分光光度仪检测抽提总RNA的浓度和纯度，本实验所测RNA样品A260/A280比值为1.8～2.0，浓度350～500 ng/μL。Bio-Rad CFX Manager 进行RT-PCR，SYBR R Premix Ex TaqTM(TaKaRa日本)为检测标志，反应体系为 10 μL。反应条件：第一步：95 ℃，30 s; 第二步：40个循环，95℃，15 s，60 ℃，30 s。引物序列TaKaRa生物公司合成序列如下: Foxp3: 正义5′-AGGGCCAGCATAGGTGCAAG-3′, 反义5′-AGTGCCTGTGTCCTCAATGGTC-3′; HO-1: 正义 5′-CTGGAGATGACACCTGAGGTCAA-3′, 反义5′-CTGACGAAGTGACGCCATCTG-3′; LIF: 正义5′-AAGAATCAACTGGCACAGCTCAA-3′, 反义5′- AGGTATGCGACCATCCGATACA-3′; IL-6: 正义5′-CAACGATGATGCACTTGCAGA-3′, 反义5′-CTCCAGGTAGCTATGGTACTCCAGA-3′; 转化生长因子(TGF-β)1: 正义5′-TACGGCAGTGGCTGAACCAA-3′, 反义5′-CGGTTCATGTCATGGATGGTG-3′。

1.2.3Western-Blot技术检测各组中小鼠胎盘组织中FOXP3、HO-1、LIF以及干扰素-6(IL-6)蛋白的表达水平：按照RIPA(西安赫特生物科技有限公司)和Bradford protein assay reagent(Bio-Rad)操作说明抽提总蛋白并进行蛋白质定量。根据蛋白定量上样，变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并将蛋白质转移到PVDF膜，膜在10%脱脂奶粉溶液中室温孵育3～4 h以封闭膜上的非特异结合。用兔抗小鼠Foxp3抗体(1∶1 000 CST)、兔抗小鼠HO-1抗体(1∶200，SNATA)、兔抗小鼠LIF抗体(1∶100, SNATA)、兔抗小鼠TGF-β1抗体(1∶200, SNATA)、兔抗小鼠IL-6抗体(1∶200，SNATA)4 ℃ 孵育过夜。洗去一抗，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔Ig G(1∶3 000)反应，增强化学发光法显色，X 线底片曝光显影。以稳定表达的基因 β-actin作为内参照。

2结果

2.1Treg治疗对LPS诱导孕鼠早产发生率的影响

LPS组所有孕鼠均在第2剂量LPS后24 h内出现早产，即孕18 d 7∶00～11∶00早产，早产率为100%; Control组孕鼠均在孕19 d以后分娩，早产率为0%; LPS+PBS组孕鼠均在第2剂量LPS后24 h内出现早产，早产率为100%; LPS+Treg组5只于孕18 d早产, 1例孕19 d分娩，早产率为83%。LPS+Treg组早产率与LPS组和LPS+PBS组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2Treg治疗对胎盘组织中Foxp3表达的影响

4组Foxp3 mRNA和蛋白水平的表达在出生时降至最低点，且各组间差异无统计学意义(P>0.05)。LPS组Foxp3 mRNA和蛋白水平的表达在第2剂LPS注射后1、6、12 h均显著低于Control组(P<0.001); LPS+Treg组Foxp3 mRNA和蛋白水平的表达在第2剂LPS注射后1、6、12 h均显著高于LPS组和LPS+PBS 组(P<0.001)，与Control组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

**P<0.01, ***P<0.001, ****P< 0.0001

图1胎盘组织Foxp3 mRNA 和蛋白水平的表达

2.3Treg治疗对胎盘组织中HO-1、LIF表达的影响

LPS组胎盘组织HO-1、LIF mRNA和蛋白水平表达在第2剂LPS注射后1、6、12 h均显著低于Control组(P<0.001); LPS+Treg组HO-1、LIF的mRNA和蛋白水平表达在第2剂LPS注射后1、6、12 h均显著高于LPS组和 LPS+PBS 组(P<0.05), 与Control组差异无统计学意义(P>0.05)。在出生时HO-1、LIF的表达各组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.4Treg治疗对胎盘组织IL-6表达的影响

LPS组和LPS+PBS组胎盘组织IL-6 mRNA和蛋白质的表达在1、6、12 h和出生时均显著高于对照组(P<0.01); LPS+Treg组IL-6 mRNA和蛋白质的表达1、6、12 h和出生时显著低于LPS组和LPS+PBS组(P<0.05，P<0.01); 而与Control组在各时间点的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

3讨论

目前国内外关于Treg在妊娠中作用的研究绝大部分是以小鼠自发性早产模型为研究对象，而对于导致早产的最主要原因，即宫内感染诱导早产的发生机制研究很少。为探讨LPS诱导小鼠早产时Treg的作用和功能，本研究利用杂交孕17 d的Balb/C小鼠成功构建LPS诱导的早产模型，以杂交孕14 d的Balb/C小鼠脾脏的Treg作为干预手段，观察不同组别、时间点胎盘组织Foxp3、HO-1、LIF及IL-6的表达。本研究发现，LPS腹腔注射诱导早产时，胎盘组织Foxp3、HO-1、LIF mRNA 和蛋白的表达均明显低于对照组，并且这些指标在LPS干预后6 h开始降低，12 h至最低，与出生时比较差异有统计学意义，这一结果与早产发生的时间基本一致。LPS组在第2剂LPS干预后12 h，即孕18 d 早上5时没有发生早产，但于孕18 d 7∶00～11∶00开始出现早产; Treg细胞在第1剂LPS腹腔注射前1 h通过尾静脉注入孕鼠体内，LPS+Treg组胎盘组织Foxp3、HO-1、LIF mRNA和蛋白的表达均明显高于LPS组，但并未降低LPS诱导的早产率。这可能是由于：首先Treg在妊娠中的起源、扩增、迁移及功能是非常复杂的[8-9]，妊娠时许多免疫细胞如母胎界面的T细胞、B细胞、DC细胞及巨噬细胞被激活后产生趋化因子，参与Treg的迁移和免疫调节功能的发挥；其次，已有实验[10]证明Treg对于胎盘植入是具有关键作用，而Treg治疗对于怀孕后4～5 d的小鼠早产模型是无效的；再者，宫内感染导致的早产是非常复杂的免疫反应。因此，不能把研究Treg在LPS诱导早产的功能仅仅局限在观察它对早产率的影响上。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

图3胎盘组织 IL-6 mRNA 和蛋白水平的表达

IL-6是一种多功能的细胞因子，在许多炎症情况下IL-6都作为关键的炎性因子表达上调，羊水中IL-6表达增高与早产儿脑损伤密切相关；另一方面，IL-6也可作为抑制炎症反应的细胞因子，抑制某些自身免疫性疾病的炎症反应[11-12]。LIF是一种具有多种生物学功能的分泌型糖蛋白，它可以调节免疫反应，保护细胞，防止组织损伤[12], 人类和鼠类实验证明，LIF在胎盘着床期间起着重要作用[13]，它的正常表达与胎盘的成功植入有关[14]。HO-1作为唯一的诱导型的HO，它分解血红色为一氧化碳(CO)、胆绿素和游离铁，CO和胆红素(胆绿素的分解产物)均有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及细胞保护作用[15-16]。Zenclussen等[17]发现在流产小鼠的胎盘HO-1表达明显降低，而且HO-1表达减少与早期胚胎死亡有关。若母胎界面HO-1表达减少，就会导致血红素增多，其中大部分血红素进入内皮细胞引起氧化损伤，促进黏附分子的产生，减少CO的产生，低水平表达的CO可以通过促进抗炎基因的表达和抑制抗炎因子的产生而扩大炎症反应。本研究发现LPS腹腔注射可引起胎盘组织炎症反应，导致Foxp3、HO-1、LIF表达降低，IL-6表达增高，这可能是LPS诱导早产发生的机制之一。而Treg治疗后Foxp3、HO-1、LIF表达增高，IL-6表达降低，胎盘组织的炎症反应减轻。但这是否有益于机体，还需要大量的研究，一方面, Treg参与机体对抗病原体的免疫反应的利弊，与病原体的种类、参与的时间点以及急性或慢性感染有关；另一方面, Treg在感染过程中起到双重作用，它参与了多数或全部的宿主对病原体感染的免疫反应，抑制过度免疫反应造成的组织损伤，这在多数慢性感染中对宿主是有利的，但其也会抑制宿主对病原体感染发挥有效的保护性免疫反应，不利于宿主对病原体的及时清除。

综上所述，在LPS腹腔注射诱导的早产小鼠中，Treg参与了宫内感染诱导早产的发生机制、胎盘组织HO-1、LIF参与了Treg在母胎界面维持的独特的免疫微环境；Treg体内注射可以减少宫内感染导致的炎症反应，为深入了解宫内感染诱导早产的发生机制提供了新方向，为治疗宫内感染导致的炎症反应开阔了新思路。

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Effect of regulatory T cells on placental inflammation in lipopolysaccharide-induced preterm delivery mouse models

WANG Fan, LIN Xiaojie, XIAO Mi, CHEN Rujuan, Muhammad Siddiq, LIU Li

(DepartmentofNeonatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi, 710061)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of the regulatory T cells on placental inflammation in lipopolysaccharide (LPS)-induced preterm delivery mouse models. MethodsThe 17-day-old pregnant mice were divided into phosphate buffer saline (PBS) group (control group) with intraperitoneal injection of PBS, LPS group with intraperitoneal injection of LPS, LPS+PBS group with intraperitoneal injection of LPS and tail vein injection of PBS, and LPS+Treg group with intraperitoneal injection of LPS and tail vein injection of PBS. LPS-induced preterm delivery models of 17-day-old pregnant mice were established. Placenta tissues were taken for detecting the expression levels of forkhead/winged helix transcription factor (Foxp3), leukemia inhibitory factor (LIF), heme oxygenase-1 (HO-1) and interleukin 6 (IL-6) 1, 6, 12 h after the second injection of LPS and at birth. ResultsPremature delivery rate was 100% in LPS group and 0% in control group. There was no significant difference between LPS+Treg group and LPS+PBS group (P>0.05). The expression levels of Foxp3, HO-1, and LIF decreased significantly, while the level of IL-6 increased significantly in LPS group and LPS+PBS group. The expression levels of Foxp3, HO-1, LIF increased significantly in LPS+Treg group, and the expression level of IL-6 decreased significantly 1, 6, 12 h after the second injection of LPS and at birth. ConclusionIn LPS-induced preterm delivery mouse models, decreasing of the placenta tissue Tregs might be one of mechanisms of premature delivery, HO-1 and LIF participate in the unique immune microenviroment kept by Tregs in maternal-fetal interface. Tregs adoptive therapy can relieve the inflammation reaction of placenta tissue by lowering the expression level of IL-6.

KEYWORDS:forkhead/winged helix transcription factor; lipopolysaccharide; placenta; mouse model

中图分类号:R 321.4

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)07-010-05

DOI:10.7619/jcmp.201607003

通信作者:刘俐, E-mail: 2432713939@qq. com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11525914)

收稿日期:2015-12-11