缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤AMPK通路的影响

谢映红, 王　巍

(解放军第202医院, 1. 综合科; 2. 内分泌科, 辽宁 沈阳, 110003)



缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤AMPK通路的影响

谢映红1, 王巍2

(解放军第202医院, 1. 综合科; 2. 内分泌科, 辽宁 沈阳, 110003)

摘要:目的探讨缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法24只SD大鼠随机分为4组，即糖尿病缺血再灌注组(DMI/R组)、非糖尿病缺血再灌注组(NDMI/R组)、糖尿病缺血预处理组(DMIPC组)及非糖尿病缺血预处理组(NDMIPC组)。应用2%链脲佐菌素腹腔注射方法建立糖尿病大鼠模型，造模后第10周建立离体心脏灌注模型。检测各组大鼠复灌后冠脉流出液肌酸激酶含量、心肌含水率变化及心排血量、左心室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升和下降速率的恢复率，并利用Western blot方法检测心肌组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及磷酸化AMPK蛋白表达水平。结果糖尿病大鼠复灌后冠脉肌酸激酶含量及心肌含水率显著高于非糖尿病组大鼠(P<0.05)，左室功能恢复率显著低于非糖尿病组(P<0.05)，AMPK及磷酸化AMPK表达水平均显著低于非糖尿病组(P<0.05)。糖尿病大鼠缺血预处理组与缺血再灌注组上述各指标比较无显著差异(P>0.05)。结论心肌缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用不明显，可能与糖尿病大鼠心肌AMPK信号通路受抑有关。

关键词:缺血预处理; 糖尿病; 心肌缺血再灌注损伤; 腺苷酸活化蛋白激酶

心血管事件是造成糖尿病患者死亡的主要原因，其中缺血性心脏病的发病率、致死率呈逐年上升趋势[1]。心肌缺血、氧供减少可造成心肌损伤，及时恢复血流灌注可对抗缺血所造成的损伤，但血流恢复灌注过程常常会加重心肌损伤，即出现“心肌缺血再灌注损伤(MI/R)”。心肌缺血预处理(MIPC)是一种有效的内源性心肌保护措施，可对抗心肌缺血再灌注损伤。本研究构建了糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察缺血预处理对大鼠冠脉流出液肌酸激酶含量、心肌含水量、左室功能恢复率及心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK表达水平的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雄性SD大鼠24只(购于沈阳军区总医院实验中心)，体质量220～320 g。大鼠适应性喂养1周后，随机分为糖尿病组及非糖尿病组，每组12只。糖尿病组大鼠于造模前夜禁食，次日晨起按35 mg/kg腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ)枸橼酸缓冲液；非糖尿病组大鼠注射等量生理盐水。72 h后通过大鼠尾静脉采血测定血糖，血糖>16.65 mmol/L者视为糖尿病造模成功。所有动物自由摄食、饮水。

1.2材料

AMPK、p-AMPK一抗购自美国Santa cruz公司；链脲佐菌素购自美国Sigma公司；肌酸激酶检测试剂盒购自Beackman公司。心功能检测采用B10PAC16生理记录仪(CB I-800Q USA)，血糖仪(Accu-DHEK)及试纸条由德国罗氏公司提供。

1.3方法

1.3.1制备Langendorff离体心脏灌流模型：腹腔注射戊巴比妥5 mg/kg麻醉各组大鼠，开胸前5 min腹腔注射肝素500 U/kg, 开胸后迅速取出心脏，置于4 ℃改良Krebs-Henseleit (K-H, 1 mmol/L: 氯化钠118.0 mmol/L、氯化钾14.7 mmol/L、磷酸钾1.2 mmol/L、硫酸镁1.2 mmol/L、碳酸氢钠25.0 mmol/L、氯化钙1.25 mmol/L、葡萄糖10.0 mmol/L, pH 7.3～7.4)液中，并插入主动脉插管连接到Langendorff灌注装置上。经主动脉灌注38 ℃经95% O2和5% CO2混合气体饱和的K-H液(灌注压为80 cmH2O), 缺血期间关闭气体。

1.3.2糖尿病缺血再灌注模型构建：将已构建好的糖尿病组大鼠(12只)再随机分成2组，每组6只，即糖尿病缺血再灌注组(DMI/R组)及糖尿病缺血预处理组(DMIPC组)；同样，非糖尿病组大鼠(12只)也随机分成2组，每组6只，即非糖尿病缺血再灌注组(NDMI/R组)及非糖尿病缺血预处理组(NDMIPC组)。DMI/R及NDMI/R组：将心脏平衡灌流30 min后，缺血30 min，再复灌30 min。DMIPC及NDMIPC组：心脏平衡灌流10 min，缺血5 min, 再灌注5 min，连续3个循环后缺血30 min, 再复灌30 min。

1.3.3指标测定: ① 冠脉流出液CK含量测定。取复灌30 min后的冠脉流出液，12 h内用全自动生化分析仪测定CK含量，按试剂盒说明操作。② 心肌组织AMPK、p-AMPK蛋白表达测定。采用Western blot法，取100 mg组织均浆，加入裂解液，离心后取上清，用BCA法测定蛋白浓度。各样品取等量蛋白经SDS-PAGE 电泳转膜，封闭。加入一抗(AMPK、p-AMPK 1︰2 000稀释)孵育，二抗(HPR-标记的羊抗兔IgG)室温孵育。特异性反应条带经AP显色后，采用自动电泳凝胶成像分析仪分析，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值，即为AMPK蛋白表达的相对强度。③ 心肌含水率测定。实验结束后，各组大鼠取左室心肌组织，拭干，称湿重，然后置于电烤箱内，60 ℃烘干24 h后取出测干重。心肌含水率(%)=(湿重-干重)×100%。④ 左心功能恢复率测定。按文献[2]操作方法，在缺血前及复灌30 min后分别测定各组大鼠心排血量(CO)、左心室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)数值并进行前后比较，所得结果即反映左心功能恢复率。

1.4统计学分析

采用SPSS 16.0软件包进行数据分析，数据以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析(One-way Anova)，组间两两比较采用LSD方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

与非糖尿病组比较，糖尿病组各组大鼠血糖显著升高(P<0.05)，糖尿病各组大鼠血糖比较无显著差异(P>0.05)。非糖尿病大鼠中，缺血预处理组冠脉流出液CK含量较缺血再灌注组显著下降(P<0.05)。与非糖尿病组大鼠比较，糖尿病组大鼠CK含量显著升高(P<0.05)；糖尿病大鼠中，缺血预处理组与缺血预适应组比较无显著差异(P>0.05)。非糖尿病大鼠中，缺血预处理组大鼠心肌含水率显著低于缺血再灌注组大鼠(P<0.05)。与非糖尿病大鼠相比，糖尿病各组大鼠心肌含水率显著偏高(P<0.05)。糖尿病大鼠中，缺血预处理组与缺血再灌注损伤组比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血糖、冠脉流出液CK水平及心肌细胞含水率比较

与NDMI/R组比较, *P<0.05; 与NDMIPC组比较, #P<0.05。

非糖尿病大鼠中，复灌后缺血预处理组心排血量(CO)、左心室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)恢复率显著高于缺血再灌注组(P<0.05)。糖尿病大鼠中，缺血预处理组与缺血再灌注组比较，上述指标无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2　复灌后各组大鼠左心功能恢复率比较　%

与NDMI/R组比较, *P<0.05; 与NDMIPC组比较. #P<0.05。

非糖尿病大鼠中，缺血预处理组心肌AMPK、p-AMPK表达显著强于心肌再灌注损伤组(P<0.05)。糖尿病与非糖尿病各组比较，大鼠心肌AMPK、p-AMPK表达显著下降(P<0.05)。糖尿病大鼠中，缺血再灌注组与缺血预处理组比较，上述蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。见图1。

1.NDMI/R组;2.NDMIPC组;3.DMI/R组;4.DMIPC组图1 各组大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白表达水平

3讨论

Murry等[3]于20世纪80年代观察到一次或反复数次短暂缺血可使心肌在随后长时间缺血中得到保护，可提高心肌对缺血的耐受性，并首次提出缺血预处理(IPC)概念。目前，对心肌缺血再灌注损伤(MI/R)及缺血预处理的研究颇多，诸多研究均证实IPC对心肌损伤有确切的保护作用。高血糖是缺血性心脏病发生的高危因素，糖尿病患者是心梗等心血管事件的高发人群。目前关于糖尿病患者对MI/R的耐受性及IPC对其保护作用的研究结论尚不一致。有学者[4]提出糖尿病对MI/R的耐受性优于非糖尿病患者，亦有学者[5]认为糖尿病状态可加重MI/R的心肌损伤，并减弱缺血预处理的心肌保护作用。

AMPK被称为真核细胞的能量感受器，可以调节物质能量代谢。AMPK具有广泛的下游底物，除与能量合成、消耗有关，亦可抑制炎症反应，减轻氧化应激损伤。AMPK信号通路受损与糖尿病、肥胖、心血管等疾病密切相关，在疾病之间形成内在联系。心肌缺血时，心肌组织AMP浓度增加、AMP/ATP比值增高可激活AMPK，使AMPK α亚单位上的172位苏氨酸发生磷酸化，继而激活下游信号分子引起生物学效应。心肌缺血再灌注过程中存在能量代谢异常，AMPK的激活可通过促进葡萄糖转运体4(GLU-4)从胞浆转移至胞膜增加心肌对葡萄糖的摄取、利用，改善能量供应[6]。AMPK还可以通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的活性降低丙二醛辅酶A浓度，激活肉碱酯酰转移酶(CPT-1)，促进脂肪酸进入线粒体氧化，释放ATP供能[7]。除调节能量代谢外，AMPK与氧化应激及炎症反应密切相关。上述因素亦参与心肌缺血再灌注损伤的发生、发展。

本研究结果表明，非糖尿病大鼠中缺血预处理对心肌缺血再灌注损伤有确切的保护作用。在缺血预处理组中，AMPK及磷酸化AMPK表达水平明显升高，说明AMPK及其信号通路可能参与了缺血预处理对心肌的保护作用[8-9]。糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤较非糖尿病大鼠严重，表现在心肌含水率高、复灌后肌酸激酶水平偏高及左室功能恢复率降低[10-11]。而缺血预处理对上述指标无显著影响，提示缺血预处理对糖尿病大鼠心肌无确切的保护作用。糖尿病属于代谢性疾病，存在糖、脂等物质代谢异常。有研究[12]表明，糖尿病存在AMPK及其信号通路相关分子表达减少，对其各靶点的调节可能成为治疗糖尿病的新途径，但对糖尿病大鼠心肌缺血预处理过程AMPK通路相关分子的变化缺少研究。本研究显示，糖尿病组大鼠缺血预处理后AMPK及磷酸化AMPK表达减少，分析缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤几乎无保护作用，可能与其表达减少有关。

总之，心肌缺血再灌注过程存在AMPK及磷酸化AMPK表达减少，心肌缺血预处理可激活AMPK，促进AMPK磷酸化，发挥保护心肌的作用。糖尿病大鼠存在AMPK表达减少，并可能是导致缺血预处理对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤无保护作用的因素之一。

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Effect of ischemic preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury and AMPK signal pathway in diabetic rats

XIE Yinghong1, WANG Wei2

(1.ComprehensiveDepartment; 2.DepartmentofEndocrinology,The202ndHospitalofPeople′sLiberationArmy,Shenyang,Liaoning, 110003)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of myocardial ischemic preconditioning (MIPC) on myocardial ischemia reperfusion injury (MI/R) in diabetic rats. MethodsA total of 24 SD rats were divided into diabetic rats with myocardial ischemia reperfusion injury group (DMI/R group), diabetic rats with ischemic preconditioning group (DMIPC group), non-diabetic rats with myocardial ischemia reperfusion injury group (NDMI/R group) and non-diabetic rats with ischemic preconditioning group (NDMIPC group). 2% streptozotocin was used to induce diabetes mellitus in rats. The isolated heart perfusion Langendorff models were established at tenth week. Creatine kinase content of coronary outflow fluid and myocardial water content were measured. The cardiac output (CO), left ventricular developed pressure (LVDP), the maximum upstroke and decay velocities of left ventricular pressure were recorded. The protein expression level of AMPK and pAMPK were detected by Western blot analysis. ResultsCreatine kinase content of coronary outflow fluid and myocardial water content after re-perfusion in diabetic rats were significantly higher than those in the non-diabetic rats groups (P<0.05). Left ventricular function recovery rate in diabetic groups was significantly lower than that in the non-diabetic groups (P<0.05). The expression levels of AMPK and pAMPK in diabetic rats were significantly lower than those in non-diabetic rats (P<0.05). However, no significant differences in the indexes mentioned above were observed between DMI/R and DMIPC group(P>0.05). ConclusionThe protective effect of myocardial ischemic preconditioning on myocardial

ischemia reperfusion injury in diabetic rats is not obvious, which may be related to the inhibition of AMPK signaling pathway in the myocardium of diabetic rats.

KEYWORDS:ischemic preconditioning; diabetes mellitus; myocardial re-perfusion injury; AMPK

中图分类号:R 587.1

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)07-006-04

DOI:10.7619/jcmp.201607002

通信作者:王巍

基金项目:辽宁省自然科学基金(2013020220)

收稿日期:2015-12-13