2型糖尿病大鼠肝脏组织中Toll样受体4和NF-κB表达变化及意义

韩荣凤,江霞(天津市第一中心医院，天津 300192)



2型糖尿病大鼠肝脏组织中Toll样受体4和NF-κB表达变化及意义

韩荣凤,江霞(天津市第一中心医院，天津 300192)

摘要：目的观察2型糖尿病大鼠肝脏组织中Toll样受体4(TLR4)和NF-κB的表达变化，并探讨其意义。方法 将清洁级SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、胰岛素抵抗组(IR组)、糖尿病4周组(DM4周组)和糖尿病8周组(DM8周组)，动物处死前股动脉取血，测定空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)、糖化血清蛋白(GSP)、血脂等生化指标。应用RT-PCR法检测大鼠肝脏组织中TLR4 mRNA表达，免疫组化法测定肝脏组织中NF-κB蛋白表达。结果大鼠血清ALT、AST和肝脏TLR4 mRNA及NF-κB蛋白表达于NC组、IR组、DM4周组、DM8周组依次递增，DM4周组和DM8周组的FPG、TG、TC、GSP高于NC组和IR组，与NC组比较，其他3组的FINS、LDL-C均高于NC组，而HDL-C均低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。TLR4 mRNA与NF-κB蛋白表达、ALT、AST水平均呈正相关(r分别为0.706、0.974、0.950，P均<0.01)；NF-κB蛋白表达与ALT、AST水平呈正相关(r分别为0.657、0.646，P均<0.01)。结论 2型糖尿病大鼠肝脏组织中TLR4 mRNA与NF-κB蛋白表达随病情的进展而逐渐增加，TLR4/NF-κB信号通路介导炎症反应在2型糖尿病发生、发展及肝脏组织的脂肪变性中可能起重要作用。

关键词：2型糖尿病；Toll样受体4；核因子-κB；肝脏;大鼠

Toll样受体4(TLR4)是内毒素(LPS)的关键受体，为联系固有免疫和适应性免疫的纽带。TLR4主要表达于髓源性细胞，其启动的胞内信号转导在肝损伤发生、发展过程中发挥重要作用。NF-κB是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种重要转录调控因子，能与多种细胞基因的启动子和增强子序列位点发生特异性结合，通过调控多种重要的细胞因子、黏附分子和趋化因子的表达，在机体免疫应答、炎症反应及细胞生长调控等方面发挥作用。2013年3月～2014年6月,我们通过建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，动态观察TLR4和NF-κB在肝组织中的表达情况，探讨其意义。

1材料与方法

1.1材料清洁级近交系雄性SD大鼠 (购买及饲养于中国医学科学院放射研究所动物实验中心)，体质量240～270 g。普通饲料及高脂高糖乳剂(脂肪乳)：动物实验中心提供。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司。通用RT-PCR试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。兔抗鼠NF-κB单克隆抗体、即用型第二代免疫组化SP广谱试剂盒、DAB试剂盒购自天津灏阳生物工程有限公司。

1.2动物模型的建立与分组将大鼠适应性饲养5 d，随机分为正常对照组(NC组)10只及造模组30只，NC组普通饲料喂养并给予蒸馏水灌胃，造模组普通饲料喂养并予脂肪乳灌胃，8周末处死NC组8只，造模组中随机处死8只作为IR组。造模组其余22只按30 mg/kg体质量尾静脉注射小剂量STZ诱导2型糖尿病模型，3 d后，血糖测定结果>16.7 mmol/L为造模成功。造模成功大鼠再随机分成糖尿病4周组(DM 4周组)和糖尿病8周组(DM 8周组)继续分别维持普通饲料喂养并脂肪乳灌胃4周和8周后处死大鼠各8只。

1.3各组生化指标的测定用罗氏血糖仪每周检测血糖1次；处死大鼠前股动脉取血，用全自动生化分析仪测定空腹血糖(FPG)、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST，采用比色法测定糖化血清蛋白(GSP)，采用液相平衡竞争放射免疫分析法测定血清胰岛素(FINS)。

1.4大鼠肝脏组织TLR4 mRNA、NF-κB蛋白表达测定大鼠处死后立即打开腹腔，新鲜无菌分离大鼠的肝脏组织块，部分置于DEPC水处理过的冻存管中，投入液氮内保存备用，部分置于10%的中性甲醛中。①TLR4 mRNA：采用RT-PCR法。取大鼠肝脏组织按试剂操作说明书提取总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增TLR4基因片段。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃延续延伸10 min；TLR4上游引物为5′-AGAATGAGGACTGGGTGA-3′；TLR4下游引物为5′-TTGTATCGCCTTCT- TAGC-3′,扩增产物323 bp。β-actin为内参照，β-actin上游引物为5′-CACCCGC-GAGTACAACCTTC-3′；下游引物为5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′,扩增产物232 bp，行琼脂糖凝胶电泳，应用VDS凝胶影像分析系统进行吸光度扫描，计算TLR4/β-actin值。②NF-κB蛋白：大鼠肝脏组织于10%甲醛固定液中固定24 h以上，经逐级脱水、透明、浸蜡行常规石蜡包埋，4 μm厚连续石蜡切片，50～60 ℃烤箱烘干，进行HE染色。免疫组化：取石蜡切片，常规脱蜡、水化，抗原修复，3%H2O2孵育，血清封闭，PBS冲洗，滴加1∶100稀释的NF-κB p65抗体，4 ℃过夜，PBS冲洗，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育10 min，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素，37 ℃孵育15 min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。免疫组化用北航CM-2000B型生物医学图像分析系统作半定量分析，每张标本按顺序选5个视野，用平均光密度表示阳性物质的相对含量。

2结果

2.1各组生化指标水平比较NC组、IR组、DM4周组、DM8周组大鼠的ALT、AST依次递增，差异有统计学意义(P均<0.05)。DM4周组和DM8周组的FPG、TG、TC、GSP高于NC组和IR组(P<0.05)。与NC组比较，其他3组的FINS、LDL-C均高于NC组，而HDL-C均低于NC组，差异有统计学意义(P均<0.05)，见表1、2。

表1　各组血清ALT、AST、GSP、FPG及FINS水平比较

注：与NC组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05；与DM4周组相比，&P<0.05。

表2　各组血脂水平比较

注：与NC组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05；与DM4周组相比，&P<0.05。

2.2肝脏组织病理学变化HE染色显示NC组大鼠肝细胞呈单核多层状，肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射样排列，IR组大鼠肝细胞肿胀，胞质疏松，肝小叶内可见少量肝细胞小泡性脂肪变；DM4周组大鼠肝小叶结构存在，边界尚清，肝细胞中到重度脂肪变性，伴轻度炎症浸润，肝小叶内坏死灶明显增多；DM8周组大鼠肝组织小叶结构欠清，肝细胞重度脂肪变，散在点片状或灶状坏死及轻到重度炎症，部分大鼠出现小叶内大片坏死及桥接坏死，伴纤维化。

2.3肝脏组织中NF-κB蛋白及TLR4 mRNA表达变化NC组少数肝脏细胞可见弱NF-κB蛋白表达，DM组肝脏组织可见大量NF-κB蛋白强表达。NC组、IR组、DM4周组、DM8周组肝脏组织中NF-κB蛋白、TLR4 mRNA表达依次递增。见表3。

表3　各组TLR4 mRNA、NF-κB蛋白表达比较

注：与NC组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05；与DM4周组相比，&P<0.05。

2.4TLR4 mRNA、NF-κB蛋白与生化指标的相关性分析TLR4 mRNA与NF-κB蛋白表达、ALT、AST均呈正相关(r分别为0.706、0.974、0.950，P均<0.01)；NF-κB蛋白表达与ALT、AST呈正相关(r分别为0.657、0.646，P均<0.01)。

3讨论

糖尿病是一种常见的代谢性内分泌疾病，发病率、病死率、致残率均较高，其中2型糖尿病比例较高。胰岛素抵抗(IR)和胰岛素分泌不足是2型糖尿病发病的两个关键因素，但其机制尚未阐明。近年来炎症学说备受关注，认为2型糖尿病是一先天性免疫和低度慢性炎症性疾病[1～3]。

Toll样受体(TLRs)是炎症信号传递的门户蛋白，是连接天然免疫和获得性免疫系统的重要桥梁，在免疫防御反应中起重要作用。迄今为止，在哺乳动物中已发现13个TLR成员。其中，TLR4是第一个被发现的哺乳动物TLRs，亦是该家族中目前研究最为详尽的成员，其主要表达于淋巴样组织、外周血白细胞、树突状细胞及T、B淋巴细胞上。TLR4的基本功能是信号的跨膜转导，其可通过广泛而特异地识别病原体相关的分子模式，偶联信号转导通路，激活天然免疫细胞和炎症细胞，最终导致一系列的免疫炎症反应[4]。2型糖尿病常缺乏直接病原微生物的侵入，故炎症反应的激活机制目前尚未明了。研究显示TLR4除可识别病原微生物外尚可识别内源性配体[5]，提示TLR4可参与非病原体侵入性组织损伤时免疫炎症反应的激活。与肥胖有关的炎性反应是2型糖尿病的致病因子之一。体外实验中脂多糖和游离脂肪酸可增加3T3-L1脂肪细胞中TLR4的表达，并通过NK-κB信号途径使炎性反应因子TNF-α和IL-6表达增强，进一步产生IR[6]。另有研究表明，TLR4介导的炎症反应可能在2型糖尿病患者β细胞功能障碍中发挥重要作用[7]。本实验发现，随着糖尿病的发展，大鼠肝脏组织中TLR4 mRNA表达上调，肝脏组织脂肪变性和炎症反应逐渐加重。有研究显示，在TLR4基因突变小鼠中，TLR4活性降低可减轻白色脂肪组织中炎性反应和葡萄糖的转运，脂联素和相关脂肪生成的标记蛋白减少，使棕色脂肪组织中解耦联蛋白-1表达减少，最终使肝脏中甘油三酯的含量减少，延缓肝细胞的脂肪变性[8]。

NF-κB是1986年Singh等[9]从B淋巴细胞、浆细胞核中检测到的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子10 bpDNA序列特异性结合的蛋白质，NF-κB目前被认为是应激反应尤其是炎症过程的关键调控因子。NF-κB信号途径在TLR4介导的免疫调节中起重要作用[10]。NF-κB过度活化一方面可使炎性反应相关基因表达异常，激活炎性反应与组织损伤；另一方面可通过组织损伤暴露出的大量内源性TLR4配体而诱导TLR4的进一步表达与活化。有研究表明，TLR4/NF-κB信号途径有可能作为桥梁将天然免疫、脂肪代谢、IR等联系起来[11，12]。本实验结果显示，随着2型糖尿病的发生及发展，大鼠肝脏组织中的NF-κB阳性着色逐渐加重，表达逐渐增强，且与TLR4的表达呈正相关，结合肝脏的病理及肝酶均提示肝脏损伤随病程的发展而逐渐加重，由此表明，TLR4/NF-κB通路在2型糖尿病肝脏损伤起重要作用。

综上所述，2型糖尿病大鼠肝脏组织中TLR4 mRNA与NF-κB蛋白表达随病情进展而逐渐升高，TLR4/NF-κB信号通路介导炎症反应在2型糖尿病发生、发展及肝脏组织的脂肪变性中可能起重要作用，阻断该通路能否延缓糖尿病及其并发症的发展有待进一步研究证实。

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(收稿日期：2015-09-26)

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.010