柿叶中总黄酮的超声提取工艺研究

杨露，李小芳，罗开沛，刘海霞，林浩，严敏嘉，吴超群

·炮制制剂·

柿叶中总黄酮的超声提取工艺研究

杨露，李小芳，罗开沛，刘海霞，林浩，严敏嘉，吴超群

目的：考察超声法提取柿叶中总黄酮的最佳工艺。方法：通过单因素试验，考察不同乙醇浓度、溶剂用量、超声时间及超声温度对柿叶中总黄酮得率的影响，在此基础上采用超声提取法，以正交试验优选出柿叶总黄酮的最佳提取工艺。结果：各因素对柿叶总黄酮得率的影响顺序为：乙醇浓度＞超声温度＞超声时间＞溶剂用量。柿叶总黄酮最佳提取工艺为：以40倍量的 40%乙醇为溶剂，在60℃下超声50 min，柿叶总黄酮得率为6.36%。结论：超声法提取柿叶总黄酮操作简单，稳定可行。

柿叶；总黄酮；提取工艺；超声波

柿叶是柿树科植物柿Diospyros kaki Thunb.的叶片，在我国作为药用及茶饮具有悠久的历史。本品味苦、性寒，具有生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血等功效，单方制剂脑心清片已被药典收载作为治疗冠心病、脑动脉硬化等疾病的法定药[1]。现代研究表明，柿叶中主要有效成分为黄酮类物质，如槲皮素、山奈酚、芦丁等，对心脑血管系统有降低胆固醇、降低血脂、抑制血栓形成以及扩张动脉等作用，此外，柿叶黄酮在抗菌消炎、抗氧化、抗癌等方面也具有作用[2-4]。本实验对柿叶中总黄酮进行了提取工艺研究，以期促进柿叶的有效利用及进一步开发。

1 仪器与试药

UV-6100 型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），PS-60A 型超声波清洗器（350W，40kHz，宁波新芝生物科技股份有限公司），BP211DAG 型电子天平（德国Satorius)，DFY-300型摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司），UPT-I-10T 型超纯水器（成都超纯科技有限公司），电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）。柿叶购于安国同利中药材公司(经成都中医药大学生药研究室鉴定为柿树科柿叶)碎至粗粉，备用。芦丁对照品购于成都曼思特生物科技有限公司（批号: MUST-15091104），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取真空干燥至恒重的芦丁对照品10.40 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇20 mL超声溶解，放冷，再用甲醇定容至刻度，摇匀，得0.2080 mg·mL-1的标准溶液。

2.1.2 线性关系考察 以紫外-可见光分光光度计进行全波长扫描，发现芦丁在510.5 nm 处存在最大吸收。精密移取标准溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置于6只10 mL 容量瓶，加水至4 mL后，加入5% NaNO20.3 mL，摇匀，置放6 min，再加10% Al(NO3)30.3 mL，摇匀，置放6 min，最后加入4% NaOH 4 mL，以水定容至刻度，摇匀，置放15 min，并用相应试剂作空白对照，在波长为510.5 nm 处测定吸光度。以浓度C(mg·mL-1)作横坐标，吸光度A(Abs)作纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=10.555C+0.034(R=0.9996),表明浓度在0.0208 0 mg ·mL-1～0.07280 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3 供试品溶液的制备与测定 称取柿叶粗粉1.0 g，置于圆底烧瓶，在不同条件下，以固定频率为350 w的超声清洗器进行超声提取，提取液过滤后，以原提取溶剂定容于100 mL的容量瓶中。精密移取1 mL于10 mL容量瓶内，并以原溶剂定容至刻度，按照2.1.2项下方法测定吸光度，并以此计算柿叶中总黄酮得率。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取方法筛选 固定提取时间为30 min，溶剂用量为50倍量，乙醇浓度为70%，分别采用回流法（温度80℃）、超声法（温度为50℃）、半仿生法（依次用pH为2、7.5、8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液提取）及水煎煮法进行提取。结果如图1所示，超声提取效果最佳，故选择此法作柿叶总黄酮提取方法。

图1 提取对提取效果的影响

2.2.2 乙醇浓度对提取效果的影响 水、甲醇、乙醇均是黄酮类成分的常用提取溶剂，但考虑甲醇成本高且毒性相对较大，不作考察；预试验中分别以乙醇及水做溶剂进行提取，结果乙醇对柿叶总黄酮的提取效果优于水，故而选择乙醇做溶剂。采用超声提取法，固定溶剂用量为50倍量，超声温度为50℃，超声时间为30 min，设计乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%，考察不同乙醇浓度对柿叶总黄酮提取效果的影响。结果如图2所示，乙醇浓度在20%～50%时，随着浓度的增加，柿叶总黄酮的得率随之增加；当乙醇浓度大于50%后，总黄酮得率降低。这可能是因为乙醇浓度增加，对黄酮类物质在乙醇溶液中的溶解起到促进作用；当浓度增加到一定程度时，溶剂极性随之减弱，增加了与黄酮类物质的极性差距，因而导致溶出率下降，

总黄酮得率反而降低。故选择40%、50%、60%的乙醇浓度进行优化。

图2 乙醇浓度对提取效果的影响

2.2.3 溶剂用量对提取效果的影响 固定乙醇浓度为50%，超声温度为50℃，超声时间为30 min，设计溶剂用量分别为：10、20、30、40、50、60倍量，考察不同的溶剂用量对柿叶总黄酮提取效果的影响。结果如图3所示，乙醇用量为10倍量至50倍量范围内，随着溶剂用量的增加，柿叶总黄酮得率随之增加；当超过50倍量，柿叶总黄酮得率降低。其原因可能是随着溶剂用量的增加，柿叶粗粉与溶剂之间接触面增大，使得柿叶中黄酮类物质转移入溶剂的扩散系数提高，从而提取得率增加。故选择乙醇用量40、50、60倍进行优化。2.2.4 超声温度对提取效果的影响 固定乙醇浓度为50%，乙醇用量为50倍量，超声时间为30 min，设计超声温度分别为：20、30、40、50、60℃，考察不同的超声温度对柿叶总黄酮提取效果的影响。结果如图4所示，随着超声温度的升高，柿叶总黄酮得率随之增加，但当温度高于40℃后，得率增加幅度有所减缓，这可能是由于过高温度使柿叶中部分黄酮类物质分解，影响得率。故选择40、50、60℃作为优化的超声温度。

图3 溶剂用量对提取效果的影响

图4 超声温度对提取效果的影响

2.2.5 超声时间对提取效果的影响 固定乙醇浓度为50%，溶剂用量为50倍量，超声温度为60℃，设计超声时间分别为10、20、30、40、50、60 min，考察不同的超声时间对柿叶总黄酮提取效果的影响。如图5所示，随着超声时间的增加，柿叶总黄酮得率逐渐提高，但当超声时间超过30 min后，得率差异较小。这可能是因为超声时间延长，溶剂对柿叶粗粉的浸透充分，促进有效成分的充分溶出，使得率增加，但时间过久，超声波的空化效应会导致某些黄酮类成分分解受损，总黄酮提取率受影响。此外,超声时间过久，对细胞破坏较大，可能提出大量杂质，给分离纯化带来困难。故选择超声30、40、50 min进行优化。

图5 超声时间对提取效果的影响

2.3 正交试验

在上述单因素试验基础上，安排L9（34）正交试验，进一步考察乙醇浓度、溶剂用量、超声温度、超声时间4个因素对柿叶中总黄酮得率的影响，优化超声法提取柿叶总黄酮的最佳工艺。因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

从表2直观分析可知，影响柿叶总黄酮得率的因素顺序为：A（乙醇浓度）＞C（超声温度）＞D（超声时间）＞B（溶剂用量）。表3方差分析表明，四个因素中，乙醇浓度、超声时间与超声温度对柿叶总黄酮得率影响表现显著（p ＜ 0.05），理论得出柿叶总黄酮最佳提取工艺条件组合为A1B1C3D3，即在乙醇浓度为40%、溶剂用量为40倍量、超声温度为60℃、超声时间为50 min的条件下进行超声提取，柿叶总黄酮的提取效果最优。

2.4 验证试验

称取柿叶粗粉1 g，在上述优选出的最佳工艺条件下进行3次平行试验，分别测得柿叶总黄酮平均得率为6.35%、6.26%、6.46%，平均得率为6.36%，RSD为1.58%。

3 讨论

超声提取技术作为中药提取新方法,综合利用了机械效应、热效应及空穴作用，通过超声波有效破坏药物细胞与膜结构，增加有效成分的穿透力从而促进有效成分溶出[5-6]。本文通过单因素实验及正交试验，确定了超声法提取柿叶中总黄酮的最佳工艺：以40倍量的 40%乙醇为溶剂，在60℃下超声50 min。验证试验表明超声提取柿叶中总黄酮得率高、稳定性好。可见，该提取方法节能、省时、操作简单稳定可行。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S].一部.北京: 中国医药科技出版社,2015．

[2] 周鑫堂, 王丽莉, 韩璐, 等. 柿叶化学成分和药理作用研究进展[J]. 中草药, 2014, 21: 030.

[3] 陈丽, 梁宇红, 裴世成, 等. 柿叶总黄酮对高脂血症大鼠血脂和血液流变学的影响[J]. 中成药, 2011, 33(8): 1397.

[4] 张艳. 柿叶黄酮体外抗氧化活性及对小鼠急性肝损伤保护作用的研究 [D]. 西安: 陕西师范大学, 2011.

[5] 钟玲,尹蓉莉,张仲林.超声提取技术在中药提取中的研究进展[J].西南军医,2007,,9 卷(6):84.

[6] 潘冬梅, 李向荣. 车前子总黄酮的超声辅助提取工艺优化[J]. 浙江中医杂志, 2014, 49(12): 924.

(责任编辑：李芸霞)

Study on the extraction process of total favonoids in persimmon leaves

/YANG Lu, LI Xiao-Fang, LUO Kai-pei, LIUHai-xia, LIN Hao, YAN Min-jia, WU Chao-qun//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To investigate the optimal ultrasonic extraction of total favonoids in persimmon Leaves. Method: The effects of different factors including ethanol concentration, solvent consumption, ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of favonoids in persimmon leaves were investigated using single factor test. On this basis, the extraction process of persimmon leaf total favonoids was optimized using ultrasonic extraction method with orthogonal test. Result: The infuence of various factors on the persimmon leaf total favonoids yield was in the order as: ethanol concentration＞ ultrasonic temperature＞ultrasonic time＞ solid-liquid ratio. The optimum extraction process of persimmon leaf total favonoids was as follows: 40 volume of 40% ethanol as solvent, ultrasonic extraction at 60 ℃ for 50 min with the total favonoids of 6.36%. Conclusion: Ultrasonic extraction of persimmon leaf total favonoids is simple, stable and feasible.

Persimmon leaf; total favonoids; extraction process; ultrasonic

R 284.2

A

1674-926X(2016)06-008-04

四川省教育厅重点项目（15ZA0094）；成都中医药大学研实践创新课题重点项目（ky2015-004）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

杨露（1992-），女，硕士研究生，主要从事中药新制剂、新剂型、新技术方向研究

Tel:18381095021 Email:yanglulu.l123@foxmail.com

李小芳（1954-），女，教授，博士生导师，主要从事中药新制剂、新剂型、新技术方向研究

Email:lixiaofang918@163.com

2015-12-30