虎杖药渣纤维素降解菌的筛选及酶活性测定

吴清华，王辉，马云桐， 谭友莉， 王承明，刘薇

·炮制制剂·

虎杖药渣纤维素降解菌的筛选及酶活性测定

吴清华1，王辉2，马云桐1， 谭友莉1， 王承明1，刘薇1

目的：以虎杖药渣和羧甲基纤维素钠为碳源，通过平板初筛及多种酶活性综合测定，筛选出具有降解纤维素作用的菌种。方法：通过不同培养基及菌种水解圈的大小作为指标，筛选纤维素降解菌并通过菌种发酵测定虎杖药渣纤维素酶的活性。结果：初筛得到7种具有降解虎杖药渣的纤维素降解菌，各种菌种的活性差异较大。结论：通过本实验研究虎杖药渣中纤维素降解菌与酶活性的关系，探索生物酶处理技术应用于虎杖药渣中的前景，为药渣的再次开发利用提供理论依据。

药渣；纤维素降解菌；纤维素酶

中药药渣来源于中成药原料药生产、中药饮片的加工与炮制，以及含中药成分的轻化工产品的生产等，其中以中成药生产带来的药渣量最大，约占药渣总量的70%[1]。目前，随着中草药和中成药的应用日益广泛，提取药用成分后产生的药渣也逐年增加，由于目前药渣的处理技术还不完善，导致许多药厂集中地区药渣堆积如山。据统计，我国仅植物类药渣年排放量就高达65万多吨[2]。如果将这些药渣简单的堆放在外面，不仅会造成环境污染，还会给周边居民的生产和生活造成严重危害，同时也增加了企业处理这些药渣的经济负担，如何有效处理这些药渣的问题已日益突出。本研究的目的就是利用以纤维素为唯一碳源的方法从土壤中筛选出高效无毒的纤维素降解菌，再从中复筛出较好的菌株，以便将药渣进行再次开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虎杖药渣 四川巴中普瑞制药厂生产的解毒降脂片（虎杖单味药制剂）提取过后的药渣，晒干，打粉。

1.1.2 含菌样品 浅层土壤样品：在采集地选取1 m2范围内多个不同点采集腐殖质较厚、地表层湿润且肥沃的土壤样品2 cm3，装入采样袋密封。

深层封土样品：在腐殖质含量较高且湿润的地方，取地下5 cm深处的土样1 cm3，装入同一密封袋混合均匀后密封。

含菌木样：选取腐化程度较高的植物枝叶样品，或者有真菌生长的死亡枝干，用工具取下5 cm左右长度样品于密封袋中密封。采样完成后编号并立即带回实验室，保存于4 ℃的冰箱中备用。

1.1.3 培养基[3]富集培养基：（NH4）2SO41.4 g，K2HPO42.0 g， MgSO4•7H2O 0.3 g，FeSO4•7H2O 5.0 mg，CaCl20.3 g，MgSO4•H2O 1.6 mg， CoCl22.0 mg， ZnSO41.7 mg，虎杖药渣粉30 g 用蒸馏水定容至1 L。

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基：MgSO4•7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，KH2PO40.5 g，CMC-Na 15.0 g，琼脂20 g；用去离子水定容1 L，pH自然，121 ℃灭菌。

纤维素-刚果红固体培养基：NaCl 0.5 g，KH2PO42.0 g，(NH4)2SO41.0 g，MgSO40.5 g，CMC-Na 20 g，琼脂20 g，刚果红 0.2 g，用去离子水定容1 L，PH自然，121 ℃灭菌。

保藏培养基--PDA培养基(W/V )：去皮马铃薯200 g；葡萄糖 20 g；蛋白胨10 g； MgSO4•7H2O 1.5 g； KH2PO43 g；琼脂粉 20 g；维生素B1 10 mg；蒸馏水 1000 ml，温度105 ℃，灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 富集培养 称取菌种来源样品各5 g，加入以虎杖药渣为惟一碳源的100 mL富集培养基中，35 ℃恒温振荡培养7-10天，吸取5 mL培养液转入新的富集培养基，传代培养3次。

1.2.2 菌种初筛 取传代3次的培养液适当稀释，在纤维素-刚果红固体培养基上分离纯化菌种，观察培养皿中是否出现水解环以及水解环的大小。同时参考水解环产生的先后及清晰度，初步比较不同菌株的纤维素酶活性，并确定用于酶活性测定的菌株。

1.2.3 酶活性测定[4,5]采用DNS还原糖法测定各纤维素酶活性。总酶活（FPA）的测定：取2支15 mL刻度的试管，各加1.0 mL粗酶液，再加pH7.0的Tris-HCl缓冲液1.0 mL。测定管加入1 cm×6 cm滤纸条，充分浸泡于50 ℃恒温水浴60 min，空白管同时置于50 ℃恒温水浴60 min。然后分别加入DNS显色液1.5 mL，空白管同时加入1 cm×6 cm滤纸条。沸水浴5 min，冷却后加水定容至15 mL，以空白管凋零点，在540 nm处测OD值。内切酶酶活（Cx）的测定：取2支15 mL刻度的试管，各加1.0 mL粗酶液。测定管加1.0 mL1%的CMC-Na，空白管只加pH7.0的Tris-HCl缓冲液1.0 mL。然后置于50 ℃恒温水浴60 min。再分别加入DNS显色液1.5 mL，置沸水浴锅反应5 min，冷却后加水定容至15 mL，以空白管凋零点，在540 nm处测OD值。β一葡萄糖苷酶（ Cb）酶活测定需把Cx测定中的CMC-Na（质量分数1%）换成水杨苷（质量分数0.5%）。

2 结果与分析

2.1 菌种初筛结果

将来自堆放的腐烂植物的肥沃土壤及深层封土等作样品，在以虎杖药渣为惟一碳源的培养基中进行3次传代培养，取其菌液涂布于CMC-Na固体培养基中，待其长出菌落后，进行平板划线法分离，分离得到一系列纤维素降解菌。然后将分离得到的纤维素降解菌分别接种在纤维素-刚果红固体培养基上观察其生长情况。纤维素降解菌能快速地在纤维素-刚果红固体培养基上产生明显的水解环。试验表明，其中有7种菌种在平板上能较快地产生较大的水解环。图1是选取其中2种菌株在培养基上的水解环，说明它们具有较高的纤维素酶酶活。

图1 其中2种菌株在纤维素-刚果红固体培养基中的水解环

2.2 菌种复筛结果

纤维素的降解是多种酶相互作用的结果，多酶体系包括内切酶、外切酶、β一葡萄糖苷酶3种主要成分。为此选择FPA、Cx、Cb3种酶活大小作为菌种的复筛依据。

将菌种分别接入以药渣和CMC-Na为碳源的液体发酵培养基，恒温培养5～7 d后的酶活性测定结果如表1所示。通过对以药渣和CMC-Na为碳源的两种发酵方式进行酶活性测定，筛选得到了7株酶系组成不同的菌株。由试验结果可知，对于FPA和Cx，以药渣为碳源的2、7号菌株和以CMC-Na为碳源的5、7号菌株较高，且它们的Cx与其他菌相比差异较大；Cb相对于其他其他酶活差异较大，Cb和FPA 在菌株之间差异都较小。酶活测定结果与水解环测定结果基本吻合，进一步验证了用纤维素-刚果红固体培养基平板筛选纤维素降解菌的方法是比较合理可行的。

表1 菌种发酵酶活测定结果

3 讨论

为了获得尽可能多的优良降解菌，一般采用多种方法对纤维素降解菌进行筛选。本试验采用传统纤维素-刚果红培养基平板法进行初筛和多种纤维素酶活综合测定进行复筛相结合，以防止遗漏优良菌种。通过筛选得到了7株酶活较高的菌种，其中6、7号菌株的酶活最好，对其以药渣为碳源的发酵，FPA分别达7.750、7.417 U/mL，Cx分别为11.750、18.083 U/mL，Cb分别为99.750、21.500 U/mL。说明了纤维素的降解是多种酶体系协同作用的结果，以多种酶指标进行纤维素降解菌的筛选是一种更为有效的筛选方法。

今后可以结合药渣降解，进一步加强微生物参与利用纤维素降解生产，这对缓解能源危机和环境污染等问题具有重要影响。纤维素酶是目前糖苷酶类中唯一尚有大量亟待解决问题的酶，同时也是有着巨大工业和市场潜力的酶[6]。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，纤维素的高效降解与微生物之间的相互作用关系还需要作更深入的研究。

[1] 刘萍,张海英.试论中药药渣的合理利用[J].新疆中医药, 2006,20(6):49.

[2] 杨磊,夏禄华,张衷华,等.植物提取生产中固形废弃物生态化利用的现状[J].现代化工,2008,28(4):14.

[3] 刘韬滔,淑霞龙,传南,等.纤维素降解菌L-06的筛选、鉴定及其产酶条件的分析[J].生物工程学报,2008,24(6):1112-1116.

[4] 张楠,杨兴明,徐阳,等.高温纤维素降解菌的筛选和酶活性测定及鉴定[J].南京农业大学学报,2010,33(3):82-87.

[5] 刘长莉,王小芬,牛俊玲,等.一组纤维素分解菌复合系NSC-7的酶活表达特征[J].微生物学通报,2008,35(5):720-724.

[6] 顾方媛,陈朝银,石家骥,等.纤维素酶的研究进展与发展趋势[J].微生物学杂志,2008,28(1):83-87.

(责任编辑：傅舒)

Screen and enzyme activity determination of cellulose degrading bacteria from Huzhang

/WU Qing-hua1, WANG hui2,MA Yun-tong1, TAN You-li1, WANG Cheng-ming1, LIU Wei1//(1. National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2.Key Laboratory of Distinct Plant Development Research, Dazhou College of Arts and Sciences, Dazhou 635000, Sichuan)

Objective: Using cellulose residue and carboxymethyl cellulose sodium as carbon source, the strains with cellulose degrading effect were screened out by plate screening and enzyme activities determination . Method: Cellulase degrading bacteria were screened by different culture medium and the size of hydrolysis loop of the strain. Cellulase activity of Huzhang residue was determined by fermentation. Result: Seven kinds of cellulolytic bacteria which can degrade drug residue were obtained with various enzyme activities. Conclusion: In this study, the relationship between cellulolytic bacteria and enzymatic activity in the residue of Huzhang is studied. The prospect of biological enzymatic treatment in the residue of Huzhang is explored to provide the theoretical basis for further development and utilization of drug residue.

Dregs; cellulose degradation bacteria; cellulase

R 283.5

A

1674-926X(2016)06-007-02

四川省高校重点实验室四川文理学院特色植物开发研究重点实验室开放课题（sctz201303）

1. 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；

2.四川达州文理学院特色植物开发研究重点实验室，四川 达州 635000

吴清华（1986-），博士，女，讲师，从事中药品种、品质与质量评价

2016-04-10