分子检测技术诊断骨关节结核及其耐药性的研究进展

王桂荣 黄海荣



·综述·

分子检测技术诊断骨关节结核及其耐药性的研究进展

王桂荣 黄海荣

骨关节结核约占肺外结核的15%，由于症状不典型，易导致漏诊、误诊。细菌学检查是结核病诊断的金标准，但传统实验室方法诊断骨关节结核的敏感度低、耗时长，不能满足骨关节结核快速诊断的需要。近年来分子诊断技术在结核病诊断中发挥越来越重要的作用，作者综述了基因芯片技术、线性探针技术和Xpert MTB/RIF技术诊断骨关节结核及其耐药性的研究进展，以便为选择骨关节结核实验室诊断方法提供依据。

结核，骨关节； 分子诊断技术； 结核, 抗多种药物性； 综述

结核病(tuberculosis，TB)是一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病，可累及全身几乎所有的器官和组织。结核病在全球导致死亡的感染性疾病中排名第二，仅次于人类获得性免疫缺陷综合征[1]。据WHO《2015年全球结核病年报》报告，2014年我国新增结核病患者93万例，其中22%为肺外结核患者[1]。我国也是全球27个耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)高负担国家之一，中国的MDR-TB患者例数占世界的17.33%[1-2]。骨关节结核绝大多数继发于肺结核，结核分枝杆菌通过血行或淋巴系统传播至骨关节，发生于供血丰富、负重程度大的骨质或活动较多的关节滑膜。骨关节结核占所有结核病患者例数的3%～5%，占肺外结核患者例数的15%[3]。患者若长期得不到有效治疗，会大大增加后遗症风险，如脊柱弯曲、棘突隆起、背部“驼峰”畸形、截瘫等，这些后遗症将给患者造成终生身体和精神上的痛苦[4]。因此，在MDR-TB高负担国家中，快速诊断骨关节结核及其耐药性，对骨关节结核的早期诊断和早期治疗，以及对结核病疫情的控制均具有重要意义。

由于骨关节结核临床表现不典型、病变位置深、标本不易获得，加之病灶含菌量少，给骨关节结核的诊断带来了严峻挑战。细菌学检查是结核病诊断的金标准，但传统实验室诊断方法中脓液涂片抗酸染色阳性率为10%～30%[5]，脓液结核分枝杆菌培养阳性率为10%～60%[6]，而且耗时较长，不能满足骨关节结核快速诊断的需要。准确及时的结核分枝杆菌耐药检测是指导临床早期开展个体化治疗、控制结核病流行的前提。而传统药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，从培养到获得药敏试验结果需8～12周，不能满足耐药骨关节结核的早期治疗。以PCR技术为基础的分子诊断技术在快速诊断结核病及其耐药性中已发挥重要作用，而且该领域仍在不断改进和发展中，使其操作更加简便、成本更加低廉。笔者将综述常用分子检测技术诊断骨关节结核及其耐药性的研究进展。

一、基因芯片技术

基因芯片技术的基本原理是通过微阵列技术将多种DNA探针有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，然后与标记的样品杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息[7]。基因芯片技术作为一种高通量自动化检测技术，在病原微生物分子诊断方面可用于菌种鉴定、分型、诊断、耐药性检测等多个领域，具有快速、准确、高通量、自动化程度高等优点。Zhang等[8]评估了CapitalBioTM基因芯片诊断脊柱结核及其对利福平和异烟肼的耐药情况，结果表明与BACTEC MGIT 960系统相比，CapitalBioTM基因芯片诊断脊柱结核的敏感度为93.55%，检测利福平耐药的敏感度为88.9%，特异度为90.7%；检测异烟肼耐药的敏感度为80.0%，特异度为91.0%。刘军兰等[9]报道基因芯片检测关节液中结核分枝杆菌的准确率为86.44%。程鹏等[10]报道采用基因芯片技术对脊柱结核临床分离株进行检测，发现对链霉素、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星和卷曲霉素耐药的敏感度分别为90.36%、61.90%、94.59%、66.00%和65.52%，其对应的特异度分别为70.37%、58.11%、58.00%、91.95%和80.56%；在26株全敏感菌株中，对5种抗结核药物耐药检测的特异度均为100%。可见基因芯片法诊断骨关节结核及结核分枝杆菌对一线、二线抗结核药物耐药检测的敏感度、特异度均较高。

基因芯片技术的优点：特异度强、敏感度高、检测快速、可实现高通量检测；缺点：需要特殊仪器及相关软件分析系统、结果判断需要较高水平的专业人员、自动化程度不够易造成交叉污染等。与痰标本和结核分枝杆菌临床分离菌株相比，骨关节结核临床标本具有异质性大、标本含菌量少、标本处理难度大等特点，因此应用基因芯片技术诊断骨关节结核及其耐药性时，标本的处理较复杂。目前，分子检测技术在结核病尤其是耐药结核病的诊断中获得越来越多的重视，然而分子检测技术仍无法完全代替传统方法。基因芯片技术可与传统方法结合使用，指导临床开展早期、有效化疗。

二、线性探针技术

线性探针技术(line probe assay, LPA)的原理是通过应用生物素标记的特异引物进行靶核酸(DNA)的扩增，并将扩增产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶联免疫显色法显示结果，1次杂交可以检测多种靶序列[11]。比较有代表性的线性探针技术试剂盒有INNO-LPA(Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium)、GenoType MTBDRplus(Hain Lifescience, Nehren, Germany)、GenoType MTBDRsl(Hain Lifescience, Nehren, Germany)、AID(AID Diagnostika, Germany)等。INNO-LPA是最早应用于临床的LPA试剂盒，可用于结核分枝杆菌临床分离株和涂阳痰标本的结核分枝杆菌及其利福平耐药检测[12]。GenoType MTBDRplus试剂盒可用于检测结核分枝杆菌及异烟肼和利福平耐药，2008年WHO推荐GenoType MTBDRplus 试剂盒用于涂阳肺结核患者的结核分枝杆菌及其耐药性检测[13]。GenoType MTBDRsl试剂盒可检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮类和二线注射类抗结核药物耐药情况[14]。AID试剂盒含有3个独立的检测模块，模块1可同时检测利福平和异烟肼是否耐药，模块2可同时检测氟喹诺酮类和乙胺丁醇是否耐药，模块3可同时检测卡那霉素、阿米卡星和链霉素是否耐药[15]。

Meta分析显示GenoType MTBDRplus试剂盒检测利福平耐药的敏感度为98.1%，特异度为98.7%；检测异烟肼耐药的敏感度为84.3%，特异度为99.5%[16]。Gu等[17]的研究结果显示，以临床诊断参考标准为金标准，GenoType MTBDRplus 试剂盒诊断骨关节结核的敏感度为72%，特异度为100%；以药敏试验结果为金标准，GenoType MTBDRplus试剂盒检测利福平和异烟肼的敏感度分别为83.3%和85.7%，特异度均为100.0%。Molina-Moya等[18]的研究结果显示，AID试剂盒与BACTEC MGIT 960系统检测异烟肼、利福平、氟喹诺酮类、乙胺丁醇、卡那霉素或卷曲霉素、链霉素耐药的一致性分别为98.3%(59/60)、100.0%(60/60)、91.5%(54/59)、72.9%(43/59)、100.0%(51/51) 和98.0%(50/51)。Brossier等[14]报道GenoType MTBDRsl试剂盒(版本2.0)检测氟喹诺酮类、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药的敏感度分别为94.8%、90.5%、91.3%和83.0%。

LPA技术的优点：具有较高的敏感度和特异度，并可同时检测结核分枝杆菌及其耐药性，而且有些试剂盒可检测二线药物的耐药情况。缺点：LPA所含探针数量有限，不能检测出一些基因区(如ahpC、kasA、furA等)的突变，可能出现假阴性结果[19]；对实验室环境及工作人员水平要求较高。

LPA技术检测骨关节结核标本中结核分枝杆菌及其耐药性的敏感度和特异度高，检测时间短，并且可同时检测结核分枝杆菌及其耐药性，可用于早期诊断骨关节结核及其耐药性。由于骨关节结核临床标本与痰标本性质差异较大，尽量留取多种骨关节结核标本，并优化标本前处理过程，可获得较好的检测结果[20]。

三、Xpert MTB/RIF技术

Xpert MTB/RIF技术是以半巢式实时PCR技术为基础的全自动核酸扩增检测技术，以rpoB基因为靶基因，可在2 h内同时检测结核分枝杆菌和是否对利福平耐药[21-22]。2010年WHO推荐Xpert MTB/RIF技术用于肺结核的诊断，2013年WHO又推荐Xpert MTB/RIF技术用于肺外结核的诊断[23-24]。Meta分析显示Xpert MTB/RIF诊断肺外结核的敏感度为77%～83%，特异度为97%～98%[25-26]。国内外研究表明，Xpert MTB/RIF诊断骨关节结核的敏感度为63.57%～95.60，特异度为96.20%～100.00%；检测骨关节结核利福平耐药的敏感度为93.33%～100.00%，特异度为94.12%～100.00%[17,27-30]。

Xpert MTB/RIF技术的优点：自动化检测平台，操作简便，对实验室人员的水平要求较低；检测时间短，2 h即可报告结果；准确率较高；全封闭系统，可降低交叉污染率，并可降低生物安全风险。缺点：仪器和试剂较昂贵；仅能检测利福平耐药。基因芯片技术、线性探针技术和Xpert MTB/RIF技术的特点见表1。

不同标本类型及不同标本处理方法均会不同程度地影响检测的准确性，为尽可能减少误差，WHO对不同标本的预处理方法做了推荐[31]，骨关节结核标本的预处理可参照淋巴结和其他组织的推荐处理步骤，使Xpert MTB/RIF技术应用于骨关节结核的诊断具有一定可行性。由于Xpert MTB/RIF在骨关节结核快速诊断中敏感度和特异度高，检测时间短，生物安全性好，并且可同时检测利福平耐药，适用于骨关节结核及其耐药性的快速诊断。

表1 各类项目在基因芯片、线性探针和Xpert MTB/RIF技术中的特点

总之，骨关节结核若能早期诊断、早期治疗，不仅可控制病情进展，缩短治疗疗程，还可以减轻患者经济压力，减少或避免脊柱畸形。在骨关节结核的诊断中应在传统实验室诊断技术的基础上，辅以分子检测技术，相信随着检查方法的不断进步，骨关节结核的诊断将会更快速、更准确。

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(本文编辑：郭萌)

Research progress on molecular tests in diagnosis of bone and joint tuberculosis and detection of drug resistance

WANGGui-rong,HUANGHai-rong.

NationalClinicalLaboratoryonTuberculosis,BeijingKeyLaboratoryforDrugResistantTuberculosisResearch,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorInstitute,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Bone and joint tuberculosis (BJTB) accounts for about 15% of extrapulmonary TB. The atypical clinical symptoms often caused its misdiagnosis. Although, bacteriological confirmation ofM.tuberculosisremains as a gold standard for the diagnosis of TB. Conventional techniques are not sensitive enough and time consuming, which can’t provide rapid BJTB diagnosis. Nowadays, molecular tests play an important role in TB rapid diagnosis. The progresses on DNA microarray, molecular line probe assay and Xpert MTB/RIF assay in diagnosis of BJTB are discussed, which will provide a reliable basis for selecting laboratory examination methods for BJTB.

Tuberculosis, osteoarticular； Molecular diagnostic techniques； Tuberculosis, multidrug-resistant； Review

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.015

北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目(2014-3-084)；首都医科大学基础-临床科研合作基金(16JL75)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室 北京市耐药结核病研究重点实验室

黄海荣，Email：huanghairong@tb123.org

2016-04-10)