初治涂阳肺结核患者治疗前后结核分枝杆菌毒力变化的探讨

李丽 马记磊 任易 谢红 田丹 南晶 俞琦 田茂鹏 景玉凯 范雄林 王卫华



·论著·

初治涂阳肺结核患者治疗前后结核分枝杆菌毒力变化的探讨

李丽 马记磊 任易 谢红 田丹 南晶 俞琦 田茂鹏 景玉凯 范雄林 王卫华

目的 分析初治涂阳肺结核患者经抗结核药物治疗前后结核分枝杆菌(MTB)的毒力变化情况。方法 收集2014—2015年入选“武汉市初治涂阳肺结核免费隔离治疗项目”的患者中初治涂阳肺结核且经抗结核治疗2周后痰涂片仍未转阴者(未转阴组)治疗前、治疗1周后及治疗2周后分离的MTB(15株)；初治涂阳肺结核经抗结核药物治疗后2周内痰涂片转阴患者(转阴组)治疗前分离的MTB(4株)；耐多药结核病患者(对照组)治疗前分离的MTB(1株)。将上述不同类别患者不同时间点痰培养分离的MTB菌株于体外分别感染巨噬细胞3 h和96 h后，应用流式细胞术检测巨噬细胞早期凋亡水平，同时计数菌落数量，分析其变化情况。结果 未转阴组治疗前、治疗1周后、治疗2周后分离的MTB菌株感染巨噬细胞3 h后，诱导巨噬细胞早期凋亡率分别为(2.95±1.13) %、(4.21±1.92) %、(3.73±1.36) %，差异无统计学意义(F=3.38，P=0.086)；感染巨噬细胞96 h后，诱导巨噬细胞早期凋亡率分别为(4.25±0.48) %、(5.69±2.03) %、(5.06±1.25) %，差异无统计学意义(F=1.69，P=0.245)。未转阴组、转阴组及对照组患者治疗前痰培养分离的MTB菌株感染巨噬细胞3 h后诱导巨噬细胞早期凋亡率分别为(2.95±1.13) %、(4.05±1.87) %、(4.38±0.29) %，差异无统计学意义(F=1.94，P=0.380)；感染巨噬细胞96 h后，诱导巨噬细胞早期凋亡率分别为(4.25±0.48) %、(4.11±0.26) %、(5.39±0.24) %，差异有统计学意义(F=11.97，P=0.003)。各组不同治疗时间所分离的MTB菌株感染巨噬细胞后菌落数量差异无统计学意义。结论 初治涂阳肺结核经抗结核治疗后2周痰涂片仍未转阴患者所携带的MTB菌株毒力在治疗前后没有变化。

结核, 肺； 分枝杆菌，结核； 毒力； 评价研究

结核病是三大传染性疾病之一，结核分枝杆菌(MTB)是导致结核病的病原菌。宿主巨噬细胞凋亡可杀死寄生于其内的MTB，阻止其在体内播散，同时可有助于激活适应性免疫应答，因此，被认为有助于机体控制MTB的繁殖和播散[1]。低毒力MTB感染人体时，可促发免疫保护机制，诱导巨噬细胞的凋亡；而高毒力MTB则引起巨噬细胞的坏死。可见，不同毒力MTB菌株对宿主转归的影响完全不同[2]。基于此，笔者收集初治涂阳且经抗结核药物治疗2周后痰菌未转阴的肺结核患者治疗前后不同时间点的MTB临床分离株，抗结核药物治疗2周内转阴患者及耐多药结核病患者治疗前的MTB临床分离株，比较各类菌株感染巨噬细胞后诱导巨噬细胞早期凋亡的水平及计数MTB菌株数量，研究MTB菌株的毒力是否有改变。

材料和方法

1.对象：选取2014—2015年入选“武汉市初治涂阳肺结核免费隔离治疗项目”的患者作为研究对象。根据抗结核药物治疗2周后痰涂片镜检结果将患者分为两类：抗结核药物治疗后2周痰涂片镜检仍未转阴、且培养阳性的患者作为未转阴组，共5例；抗结核药物治疗2周内痰涂片镜检转阴患者作为转阴组，共4例。收集未转阴组患者治疗前、治疗后1周及治疗2周后痰培养分离的MTB菌株共15株；收集转阴组患者治疗前痰培养分离的MTB菌株共4株。筛选同时耐异烟肼和利福平的耐多药结核病患者治疗前痰培养分离的1株MTB作为对照。

2.仪器与试剂：Sigma 3K15离心机(购自德国Sigma公司)、BD Calibur流式细胞仪(购自美国BD公司)、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(购自南京凯基生物科技有限公司)、7H11琼脂培养基(购自美国BD Pharmingen公司)、U937细胞(购自上海中国科学院细胞库)、BSA-V牛血清白蛋白(购自安徽Biosharp公司)。

3.U937细胞培养：将1640+10%胎牛血清(FBS)培养基放入37 ℃水浴锅内复温，打开紫外灯照射30 min；取生长48 h、状态良好的U937细胞置于已经准备好的生物安全柜中，吸取细胞悬液，加入到无菌的15 ml离心管内，500×g离心5 min；弃上清，加入4 ml 1640+10%FBS完全培养基，吹打数次，使细胞均匀分散。按照1∶4的比例传代，取1 ml 细胞悬液和4 ml 1640+10%FBS完全培养基，加入到新的培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分布；做好标记，把培养瓶置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

4.细菌培养：打开生物安全柜内紫外灯照射30 min，取-40 ℃保存的MTB菌种各100 μl，加入至新鲜配制的7H11平板中，轻轻摇晃平板使菌液均匀分布，做好相应标记，用封口胶封口，放置37 ℃温箱中培养3周左右。7H11培养基制备采用7H11 Broth(肉汤)21 g，甘油5 ml加双蒸水溶解，定容至900 ml，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，待温度降至55 ℃，将牛血清白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(ADC)和7H11琼脂溶液按照1∶9比例配置混匀，分装至无菌的培养皿，凝固后分装备用。

5.细菌悬液制备：打开生物安全柜内紫外灯照射30 min，挑取7H11平板上生长的菌落，置于无菌已称量过的Eppendorf(EP)管中，称量EP管中不同细菌的重量，按照干重1 mg细菌所含的细菌个数为1×107计算细菌总数，把EP管中的细菌转移至匀浆器，加入一定量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，研磨细菌，使细菌均匀分散。

6.细菌感染细胞：按照细菌感染复数(multiplicity of infection，MOI)值为10感染U937细胞，4 h 后吸取细胞悬液加入到15 ml离心管中，500×g离心5 min，加入5 ml PBS重悬细胞，反复离心洗涤5次，充分去除细胞外未感染细胞的细菌，加入2 ml的新鲜完全培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

7.巨噬细胞荷菌量分析：细菌分别感染巨噬细胞3 h和96 h，收集细胞：500×g离心5 min，收集U937细胞，PBS缓冲液重悬细胞，洗涤3次，用1 ml PBS 重悬细胞；其中500 μl 用于菌落计数，剩余500 μl 用于流式分析细胞凋亡和死亡。吸取100～900 μl无菌1×PBS缓冲液，并依此进行倍比稀释至10-4梯度；从各个梯度稀释液中吸取100 μl液体加至制备好的7H11琼脂培养基三格平板的每个格子中，并做好标记；将涂布完成的平板置于37 ℃培养箱中，待液体吸收完全后倒置培养3周。3周后记录每个平板上菌落数量。根据稀释度换算得到每个孔中所包含的菌落总数。每孔巨噬细胞荷菌量以log10菌落形成单位(CFU)表示。

8.巨噬细胞凋亡和坏死检测：收集未转阴组患者治疗前、治疗后1周及治疗后2周痰培养分离的MTB，按照细菌MOI值为10感染U937细胞3 h和96 h，利用凋亡检测试剂盒进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡水平并利用FlowJo软件进行分析。500×g离心5 min，收集5×105个上述经PBS洗涤的巨噬细胞；每管加入500 μl的结合缓冲液(binding buffer)重悬细胞；加入5 μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-FITC)，充分混匀，加入5 μl 碘化丙碇(propidium iodide，PI)，混匀；室温、避光、放置5～15 min，annexin V-FITC/PI染色，1 h内应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，应用Cellquest软件获取数据。根据实验原理，annexin V单阳性为早期凋亡细胞，annexin V和PI双阳性者为晚期凋亡及坏死细胞，双阴性者为活细胞。

9. 统计学分析：采用SPSS 18.0软件进行分析，未转阴组患者不同治疗时间分离MTB感染巨噬细胞后细胞早期凋亡率的组间比较采用配对t检验，以P<0.025为差异有统计学意义。不同组别患者治疗前分离MTB菌株感染巨噬细胞后细胞早期凋亡率的比较采用方差分析。菌落计数的比较采用非参数检验Kruskal-Wallis检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.MTB诱导巨噬细胞凋亡水平：未转阴组治疗前痰培养分离MTB感染3 h后，诱导巨噬细胞早期凋亡率为(2.95±1.13) %，治疗1周后痰培养分离MTB诱导巨噬细胞早期凋亡率为(4.21±1.92) %，治疗2周后痰培养分离MTB诱导巨噬细胞早期凋亡率为(3.73±1.36) %。治疗前、治疗1周后、治疗2周后分离菌株诱导巨噬细胞凋亡率差异无统计学意义。未转阴组治疗前痰培养分离MTB感染96 h后，诱导巨噬细胞早期凋亡率为(4.25±0.48) %，治疗1周后诱导巨噬细胞早期凋亡率为(5.69±2.03) %，治疗2周后诱导巨噬细胞早期凋亡率为(5.06±1.25) %。治疗前、治疗1周后、治疗2周后分离菌株诱导巨噬细胞凋亡率差异无统计学意义。治疗前、治疗1周后、治疗2周后分离菌株，分别感染巨噬细胞不同时间(3、96 h)诱导巨噬细胞凋亡率差异无统计学意义(表1)。

比较未转阴组、转阴组及对照组患者治疗前痰培养分离MTB感染巨噬细胞3 h和96 h后诱导巨噬细胞早期凋亡水平。MTB感染巨噬细胞3 h后，未转阴组、转阴组、对照组分离MTB诱导巨噬细胞早期凋亡水平差异无统计学意义。感染巨噬细胞96 h后，未转阴组、转阴组、对照组分离MTB诱导巨噬细胞早期凋亡水平差异有统计学意义，但未转阴组与转阴组相比诱导巨噬细胞早期凋亡水平差异无统计学意义(表2)。

2.MTB感染巨噬细胞后菌落数量变化情况：MTB感染巨噬细胞3 h和96 h后，去除细胞继续培养MTB 3周后，记录每个平板上菌落数量。根据稀释度换算得到每个孔中每毫升菌液所包含的菌落总数[lg(CFU)]。结果发现，未转阴组患者治疗前分离MTB初始感染巨噬细胞菌量为7.01±0.37、感染3 h后菌量为5.75±0.30、感染96 h后菌量为6.75±0.34；治疗1周后初始感染菌量为7.10±0.29、感染3 h后菌量为5.81±0.50、感染96 h后菌量为6.82±0.43；治疗2周后初始感染菌量为7.02±0.31、感染3 h后菌量为5.70±0.34、感染96 h后菌量为6.70±0.34。对未转阴组治疗前、治疗后1周及治疗后2周菌量进行Kruskal-Wallis检验，结果显示感染不同时间点，治疗前、治疗后1周、治疗后2周组间差异无统计学意义(K-W值=0.62，P=0.733)。

表1 未转阴组患者不同治疗时间MTB分离株感染巨噬细胞后细胞早期凋亡率的比较

表2 不同组别患者治疗前MTB分离株感染

比较未转阴组、转阴组及对照组患者实际感染巨噬细胞的细菌数量、感染3 h和96 h菌落数量变化情况，结果表明，未转阴组治疗前初始感染菌量为7.01±0.37、感染3 h后菌量为5.75±0.30、感染96 h后菌量为6.75±0.34；转阴组治疗前初始感染菌量为7.11±0.36、感染3 h后菌量为5.81±0.24、感染96 h后菌量为6.98±0.17；对照组治疗前初始感染菌量为6.97±0.03、感染3 h后菌量为5.46±0.05、感染96 h后菌量为6.75±0.18；Kruskal-Wallis检验结果显示，抗结核治疗2周未转阴者、抗结核治疗2周内转阴者及耐多药结核病患者组间差异无统计学意义(K-W值=1.28，P=0.528)。

讨 论

MTB是典型的胞内致病菌，主要在巨噬细胞等宿主免疫系统细胞内存活和繁殖。MTB感染人体后，主要被宿主巨噬细胞吞噬，未被机体免疫系统清除而潜伏下来的MTB也主要寄生于宿主巨噬细胞内。MTB感染的后果及结核病的发生与否与宿主巨噬细胞密切相关。MTB感染后，可诱导宿主巨噬细胞产生不同的转归——凋亡或坏死[3]。凋亡可使巨噬细胞静止地将抗原提呈给T细胞，诱导细胞免疫应答，消除MTB赖以生存的环境，阻止其传播；而坏死可使宿主巨噬细胞膜破裂，使宿于其中的MTB被释放出来，重新感染周围宿主巨噬细胞，造成感染的播散。由此可见，宿主细胞的转归对MTB感染的控制极其关键。研究表明，不同毒力的MTB感染巨噬细胞后可诱导巨噬细胞产生不同的转归：高毒力MTB株H37Rv能够抑制细胞凋亡，在胞内存活、繁殖、扩散，导致细胞坏死，进而引发炎症反应、细菌扩散；而H37Ra、卡介苗(BCG)等减毒株则能诱导巨噬细胞产生大量凋亡[4]。

不同于利用小鼠模型进行的MTB毒力检测实验[5]，结果表明，对于入组的5例初治涂阳肺结核患者，相比抗结核治疗前，抗结核治疗1周或2周后分离的结核分枝杆菌诱导巨噬细胞早期凋亡水平均有不同程度的上升，但不同患者结果间表现出异质性。MTB感染巨噬细胞3 h后，5例中有4例患者抗结核治疗1周及2周后巨噬细胞凋亡水平较治疗前均有不同程度上升。未转阴组患者，在抗结核治疗1周或2周后分离的MTB较治疗前诱导巨噬细胞凋亡水平均有上升，但差异无统计学意义。究其原因，可能由于本研究纳入患者数量及MTB临床分离株较少，有必要增加样本量做进一步研究。此外，由于笔者仅收集了抗结核药物治疗1周或2周后的MTB，若继续收集抗结核药物治疗后更长时间的菌株，可能会发现其诱导巨噬细胞早期凋亡水平的明显变化，即随着抗结核药物治疗的延续，细菌的毒力会呈现明显下降，这对结核病患者的临床治疗及结核病传染源的管理具有重要提示意义。

此外，笔者针对初治涂阳结核病患者抗结核药物治疗2周后痰涂片未转阴患者、转阴患者及耐多药结核病患者化疗前收集的MTB诱导巨噬细胞凋亡水平进行了分析。结果表明，未转阴患者、转阴患者及耐多药患者的MTB临床分离株感染巨噬细胞3 h后，其诱导巨噬细胞的早期凋亡的水平差异无统计学意义。而感染巨噬细胞96 h后，三组菌株诱导巨噬细胞早期凋亡水平差异有统计学意义，耐多药组菌株诱导巨噬细胞早期凋亡水平高于未转阴组和转阴组，而转阴组与未转阴组比较差异无统计学意义。

本研究首次利用体外细胞水平的实验初步探讨了抗结核药物治疗后不同时间点MTB毒力的变化，发现随着抗结核药物治疗的进行，细菌毒力未见明显变化。究其原因，可能由于纳入患者例数较少，同时，若延长抗结核药物治疗后收集各时间点的MTB临床分离株，可能会出现细菌毒力的明显改变。由此也提示，在临床上，肺结核患者或许需要更长时间的住院或隔离治疗才能有效地避免细菌在人群中的传播。很多研究报道MTB成分能有效抑制或促进巨噬细胞凋亡[6-9]，也有关于细菌毒力变化的相关分子水平研究[10-12]。本研究并未涉及诱导细胞凋亡的具体成分或机制，这也需要进一步地进行分子或基因水平研究，通过干预和调控宿主巨噬细胞的凋亡进程，为结核病的预防、控制和根除提供新的靶点，同时也为结核病临床治疗策略或结核病传染源管理提供理论依据。

[1] 陈思静, 卢贤瑜. 结核分枝杆菌调控巨噬细胞凋亡机理的研究进展. 国际检验医学杂志, 2005, 26(5):276-278．

[2] Sohn H, Lee KS, Kim SY, et al. Induction of cell death in human macrophages by a highly virulent Korean isolate ofMycobacteriumtuberculosisand the virulent strain H37Rv. Scand J Immunol, 2009, 69(1):43-50．

[3] Bocehino M, Galati D, Sanduzzi A, et al. Role of mycobacteria-induced monocyte/macrophage apoptosis in the pathogenesis of human tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2005, 9(4): 375-383.

[4] Brightbill HD, Libraty DH, Krutzik SR, et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science, 1999, 285(5428): 732-736.

[5] Smith KL, Saini D, Bardarov S, et al. Reduced virulence of an extensively drug-resistant outbreak strain ofMycobacteriumtuberculosisin a murine model. PLoS One, 2014, 9(4): e94953.

[6] Yuk JM, Shin DM, Yang CS, et al. Role of apoptosis-regulating signal kinase 1 in innate immune responses by Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin. Immunol Cell Biol, 2009, 87(1): 100-107.

[7] 史会连, 虞胜镭, 路蝉伊, 等. 不同毒力结核杆菌的纯化蛋白衍生物对人巨嗡细胞凋亡的诱导及其与Toll样受体-2的相关性. 中华传染病杂志, 201l, 29(1):6-10．

[8] 夏飞, 刘胜武, 魏雅雅, 等. 结核分枝杆菌诱导宿主巨噬细胞凋亡机制初探.中华微生物学和免疫学杂志, 2005, 25(6): 463-468．

[9] Yokobori N, Sabio y García CA, Geffner L, et al. Differential induction of macrophage cell death by antigens of a clustered and a non-clustered multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrain from Haarlem family. FEMS Immunol Med Microbiol, 2012, 66(3): 363-371.

[10] 薛玉, 刘毅, 张旭霞, 等. 分枝杆菌中原核类泛素蛋白化靶蛋白的功能分析. 中国防痨杂志, 2014, 36(6):509-513.

[11] 张国良, 詹森林, 钟红剑, 等. 结核分枝杆菌感染对Ⅰ型干扰素受体基因表达的影响及其在结核病患者外周血表达的意义. 中国防痨杂志, 2014, 36(6): 482-486.

[12] 马峻, 陈高瞻, 董洁莉, 等. 武汉地区耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株katG基因突变的分子特征分析. 中国防痨杂志, 2015, 37(1): 95-97.

(本文编辑：李敬文)

Analysis ofMycobacteriumtuberculosisvirulence before and after anti-tuberculosis treatment for smear positive pulmonary tuberculosis patients

LILi,MAJi-lei,RENYi,XIEHong,TIANDan,NANJing,YUQi,TIANMao-peng,JINGYu-kai,FANXiong-lin,WANGWei-hua.

WuhanInstituteforTuberculosisControl,WuhanPulmonaryHospital,Wuhan430030,China

s:WANGWei-hua,Email:drwang65@163.com;FANXiong-lin,Email:xlfan@hust.edu.cn

Objective Evaluation of virulence ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) isolated before and after treatment for newly diagnosed smear positive pulmonary tuberculosis (TB) patients. Methods Patients were recruited from Project of Free Quarantined Hospital Treatment for Newly Diagnosed Smear Positive Pulmonary TB Patients in Wuhan during 2014-2015. Fifteen strains of MTB isolated from patients before the initiation of anti-TB treatment, after one week or two weeks of anti-TB treatment from smear positive pulmonary TB patients who are still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment, four MTB strains from pulmonary TB patients who are sputum smear negative during 2 weeks of anti-TB treatment and one multidrug-resistant MTB strain before the initiation of anti-TB treatment. Macrophages were infected with the different MTB strains cultured from different time points of sputum isolated from the different types of patients mentioned above in vitro for 3 hours or 96 hours. Flow cytometry was conducted to detect the early apoptotic level of macrophages. At the same time, the number of MTB colonies was counted. Results The percentage of early apoptosis of macrophages infected with cultured MTB from sputum isolated before, after one week or two weeks of anti-TB treatment from smear positive pulmonary TB patients who were still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment were (2.95±1.13) %,(4.21±1.92) % and (3.73±1.36) % repectively, after infection for 3 h，displaying no significant difference (F=3.38,P=0.086); (4.25±0.48) %, (5.69±2.03) %, (5.06±1.25) % after infection for 96 h, displaying no significant difference (F=1.69，P=0.245). The percentage of early apoptosis of macrophages infected with cultured MTB from sputum isolated before treatment from smear positive pulmonary TB patients who were still sputum smear positive after treatment were (2.95±1.13) %,(4.05±1.87) % for who were negative after treatment and (4.38±0.29) % for MDR MTB after infection for 3 h, displaying no significant difference (F=1.94，P=0.380). The percentage were (4.25±0.48) %, (4.11±0.26) % and (5.39±0.24) % after infection for 96 h respectively, displaying no significant difference (F=11.97,P=0.003). No significant difference was observed as to the count of MTB colonies. Conclusion The virulence of MTB isolated is not significantly changed from MTB patients who are still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment.

Tuberculosis, pulmonary;Mycobacteriumtuberculosis; Virulence; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.11.016

武汉市初治涂阳肺结核免费隔离治疗项目(2012年7月)；武汉市中青年医学骨干人才培养工程(武卫生计生通〔2015〕9号)；武汉市黄鹤英才(医疗卫生)计划(武人才办〔2016〕1号)

430030 武汉市结核病防治所 武汉市肺科医院(李丽、任易、谢红、田丹、南晶、王卫华)；华中科技大学同济医学院病原生物学教研室(马记磊、俞琦、田茂鹏、景玉凯、范雄林)

王卫华，Email：drwang65@163.com；范雄林，Email：xlfan@hust.edu.cn

2016-07-01)

注：李丽、马记磊对本文有同等贡献，为并列第一作者