琼脂凝胶微球纯化葛根素的工艺研究お

吕述权 石国宗 孙丽 许远杰 王富

[摘要]葛根素是葛根中黄酮类物质主要活性成分，该研究以葛根素粗品为原料，利用廉价易得的琼脂制备琼脂凝胶微球键合β环糊精分离介质（AGβCD），结合AB8大孔树脂进行前处理，以高回收率分离纯化得到高纯度的葛根素。以葛根素纯度和回收率以及相关杂质的色谱纯度为考察指标，对4种不同性质的大孔树脂ADS7（强极性）、ADS17（中极性）、ADS21（极性）和AB8（弱极性）进行分离效果筛选以及工艺优化，并对AGβCD纯化工艺优化和验证。结果表明，优选弱极性树脂AB8作为葛根素粗品的前处理树脂效果最佳，通过8%乙醇洗脱15 BV后，葛根素纯度为8768%的回收率达到8966%；通过琼脂凝胶微球键合β环糊精分离介质进行纯化，流动相15%乙醇，承载量（上样量与柱体积之比）133 g·L-1，上样浓度8 g·L-1，流速1 mL·min-1时，葛根素纯度高于95%的回收率达到97%以上。

[关键词]葛根素；AB8树脂；琼脂凝胶微球；β环糊精

葛根是一种传统的中药材，因具有较高的食用和药用价值而被列入“药食同源植物”。葛根中的黄酮类物质为主要的药用活性成分，其中葛根素含量最高，并具有多种药用活性如改善心肌细胞膜及心律失常，抗心肌纤维化损伤、抗心血管疾病、抗糖尿病[1]、神经保护[2]、抗阿尔兹海默症[3]、抗帕金森病[4]、防治骨质疏松症[5]等作用，因此受到更为广泛的关注与研究。

葛根中化学成分复杂多样，除了葛根素外还有3′羟基葛根素，3′甲氧基葛根素等多种黄酮类化合物，由于结构类似，理化性质相近，以较高的回收率纯化制备得到高纯度的葛根素较为困难。目前分离纯化葛根素较为传统的工艺有溶剂萃取[6]，氧化铝和硅胶柱色谱[7]和大孔树脂分离[89]，但上述方法单独应用难以取得较高纯度亦或是回收率较低。利用超临界流体萃取[10]，快速离心分配色谱（FCPC）[11]，双水相萃取和高速逆流色谱（HSCCC）[12]等分离技术纯化葛根素，虽能取得较高纯度和回收率，但体系复杂，设备要求高，有机溶剂消耗大，对环保和安全生产要求过高，导致成本过高等诸多缺陷。

β环糊精（βcyclodextrin）是由7个β吡喃葡萄糖单元通过α1，4糖苷键连接形成的“外亲水，内疏水”的环状空腔结构，通过疏水作用、氢键和偶极等多种作用力形成超分子复合物[13]，根据上述特性，多种β环糊精固定相合成用于天然活性物质的分离纯化。Lai等利用硅胶基质键合β环糊精纯化表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）[14]，谭天伟研究团队先后制备了琼脂糖凝胶微球[1517]，苯乙烯聚合物[18]，甲基丙烯酸甲酯聚合物[19]，丙烯酸酯聚合物[20]键合β环糊精固定相先后用来纯化EGCG、葛根素、大豆苷等黄酮类物质，取得较为理想的效果。

本文通过廉价易得的琼脂为原料，通过乳化交联制备琼脂凝胶微球的基质，其结构上众多的羟基易于键合β环糊精，键合后的微球结构稳定，可反复使用而分离纯化性能保持不下降。结合大孔树脂初步分离，琼脂微球键合β环糊精分离介质纯化葛根素，整个工艺过程简易可行，纯化体系简单，无有毒溶剂，能够稳定得到高纯度的葛根素的前提下取得较高的回收率。

1材料

Waters e2695高效液相色谱仪（美国waters公司），2998光电二极管阵列检测器（PDA，美国waters公司），Waters C18柱（美国waters公司），色谱柱（上海华美实验仪器厂），蠕动泵（常州科健蠕动泵厂），制备型高效液相色谱仪LC3000（包括二元泵，紫外检测器，混合器，北京创新通恒科技有限公司），AUW120D半微量分析天平（日本岛津公司），大孔吸附树脂AB8，ADS7，ADS17，ADS21（天津南开和成科技有限公司）。

葛根素（PR）对照品（纯度≥98%，西安沃森生物科技有限公司），3′羟基葛根素（3HP）和3′甲氧基葛根素（3MP）对照品为反相制备柱自制，色谱纯度达到99%，葛根素粗品（批号20141221，西安沃森生物科技有限公司），甲醇（色谱纯，Merck，德国），柠檬酸（AR，天津光复精细化工研究所），无水乙醇（AR，西陇化工股份有限公司），琼脂粉（国药集团化学试剂有限公司），β环糊精（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

21琼脂凝胶微球制备

方法参考文献[20]进行修改。①琼脂凝胶裸球的制备：取100 g琼脂粉，加入1 L纯化水于100 ℃条件下搅拌溶解4 h，将琼脂水溶液趁热缓慢加入到1 L的乳化剂（环己烷山梨醇酐三油酸酯4∶1，75 ℃，200 r·min-1）中，加入后调节搅拌转速为450 r·min-1，搅拌30 min，待冷却至室温后抽滤，用无水乙醇和纯化水交替洗涤去除残余乳化剂后得到琼脂凝胶裸球；②裸球交联：取琼脂凝胶裸球100 g，加100 mL纯化水，35 ℃水浴，200 r·min-1搅拌，待裸球分散均匀后加入15 g Na2SO4，溶解30 min，继续加入50% NaOH 4 mL和NaBH412 g，以01 mL·min-1的流量加入25 mL环氧氯丙烷，并同时以0.2 mL·min-1的流量加入50 mL质量分数为50% NaOH，之后增加反应温度至50 ℃继续搅拌18 h，冷却至室温后用乙酸调节pH 50～60后抽滤，用乙醇和纯化水洗涤后得到交联的琼脂凝胶微球；③键合β环糊精：称取5 g β环糊精加入100 mL纯化水中于35 ℃水浴中以200 r·min-1的转速搅拌1 h后，加入100 g交联的琼脂凝胶微球搅拌分散均匀，后续同步骤②，得到键合β环糊精的琼脂凝胶微球（简称AGβCD）。

22葛根素含量测定

221色谱条件参考2010年版《中国药典》标准[22]，Waters C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相A（01%柠檬酸水溶液）B（甲醇），梯度洗脱（0～15 min，25% B；15～30 min，45% B；30～35 min，45% B；35～37 min，75% B；37～45 min，25% B），进样量10 μL，流速1 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长254 nm。对照品和葛根素粗品色谱图见图1。

222对照品配制精确称取100 mg葛根素对照品至50 mL量瓶，分别加甲醇溶解完全后并定容至刻度，为葛根素对照品溶液。

223供试品配制精确称取葛根素粗品50 mg至25 mL量瓶，分别加甲醇溶解完全后并定容至刻度后摇匀，过022 μm的微孔滤膜，滤液为葛根素供试品溶液。

224线性范围考察精密量取葛根素对照品溶液各8，6，4，2，1，05 mL于10 mL量瓶， 加甲醇定容到刻度线后摇匀，按照221中的色谱条件进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=463×107X+658×104，r=0999 8，线性范围01～16 g·L-1。

225精密度试验取对照品溶液，按照色谱条件221色谱条件重复进样6次，记录色谱峰面积，其RSD为026%，结果表明仪器精密度良好。

226稳定性试验取同一供试品溶液，分别放置0，2，4，8，12，24 h后，按照221色谱条件测定，记录葛根素峰面积，计算其RSD为13%，结果表明供试品溶液在24 h是稳定的。

227重复性试验精密称取葛根素粗品5份，平行制备同样供试样品溶液5份，按照221色谱条件测定，记录葛根素峰面积，计算其RSD为081%，表明重复性良好。

228加样回收率试验精密称取50 mg葛根素粗品5份，分别加入葛根素对照品溶液3 mL后25 mL量瓶定容至刻度线，按照221色谱条件测定计算，其平均加样回收率为1015%，RSD为12%。

23大孔树脂对葛根素分离效果的筛选

称取50 g葛根素粗品（约含50%葛根素），加入500 mL纯化水溶解过滤后上柱，通过4种不同性质的大孔树脂ADS7（强极性），ADS17（中极性），ADS21（极性），AB8（弱极性）对葛根素粗品进行分离，色谱柱规格为26 cm×40 cm，柱体积（BV）为（150±5） mL，乙醇梯度洗脱，洗脱顺序为：纯化水1 BV，10%乙醇2 BV，20%乙醇2 BV，30%乙醇2 BV，40%乙醇2 BV，上柱和洗脱流速为2 BV·h-1，洗脱液按照每BV收集1瓶，通过HPLC测定，检测其含量和纯度。通过葛根素的纯度和回收率以及2种主要杂质3′羟基葛根素和3′甲氧基葛根素的色谱纯度来衡量4种大孔树脂的分离效果，结果发现葛根素纯度≥80%以上的回收率分别为9129%（AB8），8181%（ADS7），6819%（ADS17），7313%（ADS21），表明AB8分离葛根素效果最佳，并且葛根素与其他2种主要杂质 3′羟基葛根素和3′甲氧基葛根素分离趋势较为明显，容易富集于低浓度乙醇洗脱剂，解析率高，利于后续纯化，见图2。

24AB8大孔树脂分离葛根素工艺优化

根据树脂筛选实验结果表明，AB8分离葛根素的趋势是3′羟基葛根素较为容易富集于10%乙醇，而 3′甲氧基葛根素富集于20%，30%乙醇。因此优化的工艺方向是增加低浓度乙醇洗脱体积，缩短3′羟基葛根素的保留时间，而增加3′甲氧基葛根素的保留时间，从而增加三者之间的分离度，利于后续葛根素纯度和回收率的提高。

在其他因素相同的条件下，按照优化方案1通过增加2 BV的8%乙醇洗脱梯度，即按照预洗1 BV纯化水，8%，10%，20%，30%，40%，50% 乙醇各依次洗脱2 BV，结果发现3′羟基葛根素与3′甲氧基葛根素分离的趋势更明显，但由于葛根素主要富集于2种杂质的交叉区间，造成回收率偏低，纯度80%以上的收率仅为6563%，见图3。

继续优化工艺，按优化方案2通过预洗1 BV纯化水后，8%乙醇连续洗脱15 BV后，能将葛根素洗脱下来，并且3′羟基葛根素与3′甲氧基葛根素分离趋势更加显著，由于3′羟基葛根素所占比例少，

aAB8；bADS7；cADS17；dADS21（0 BV为水洗液，后续依次为乙醇梯度洗脱液，图3同）。

合并3～13 BV洗脱液，见图4，合并后浓缩冻干，待AGβCD微球进一步纯化，该部分的纯度为8812%，回收率为9048%，见图3。

25AGβCD纯化葛根素研究

葛根素粗品主要的2种杂质为3′羟基葛根素和3′甲氧基葛根素，由于目标产物葛根素与2种杂质的理化性质相似，纯化过程中葛根素易与其他2种杂质交叉洗脱下来。

根据研究结果可知，AGβCD微球纯化葛根素的分离趋势与AB8大孔树脂相反，3′甲氧基葛根

素最先洗脱下来，其次是目标产物葛根素，保留时间较长的是3′羟基葛根素，见图5。图5是根据后续最佳优化工艺参数采集的分离效果图，柱体积（30±05） mL时，上样量为40 mg葛根素粗品，进样体积为5 mL，流动相为15%乙醇，流速1 mL·min-1，其纯化结果表明葛根素纯度92%以上的回收率为7554%。

26AGβCD分离纯化葛根素工艺优化

以AB8处理后浓缩冻干粉通过AGβCD进行纯化，通过流动相，承载量，流速和上样浓度4个要素依次进行纯化工艺优化，柱体积为（30±05） mL（色谱柱型号10 mm×40 cm），紫外检测器监测波长254 nm，按色谱峰顺序收集，峰宽较大时，按照10 mL收集1次，通过HPLC分析检测含量和色谱纯度。根据HPLC检测结果，合并葛根素纯度≥95%的流分，见图6。

葛根素纯度≥95%时各个优化组合时的回收率见表1。结果表明，133 g·L-1承载量（葛根素上样量与微球体积之比），流动相为15%乙醇，上柱和洗脱流速为1 mL·min-1，上柱样品质量浓度8 g·L-1时纯化效果最佳，葛根素纯度≥95%的回收率为9765%。

27验证试验

通过AB8树脂8%乙醇连续洗脱15 BV后，连续3批进行验证，3～13 BV合并液检测其色谱纯度和计算回收率；3批合并液浓缩冻干后样品分别用AGβCD微球以最佳的工艺参数进行纯化，计算其纯度≥95%以上的回收率，结果见表2，图7。

通过连续3批的验证实验结果表明，AB8大孔树脂分离葛根素平均纯度为8768%，RSD为067%时，回收率平均值为8966%，RSD为10%；AGβCD微球纯化葛根素纯度≥95%以上的回收率的平均值为9735%，RSD为0093%。RSD均小于5%，因此该分离纯化工艺是可靠的。

3结果与讨论

通过4种不同性质的大孔树脂筛选，优选弱极性的AB8树脂作为前处理树脂对葛根素粗品进行

分离，利用葛根素粗品中3′羟基葛根素（疏水常数为-03）与3′甲氧基葛根素（疏水常数为0）和葛根素（疏水常数为0）在疏水性上的微小差别，而在

弱极性树脂上的吸附保留能力上差别更加凸显的作用，即3′羟基葛根素保留能力小于葛根素和3′甲氧基葛根素，通过洗脱剂优化，从而达到初步分离的目的，并确定8%乙醇作为最佳洗脱剂，连续洗脱15 BV后，合并3～13 BV洗脱液，葛根素纯度87%以上的回收率为88%以上。利用AB8前处理样品后，AGβCD通过4个关键工艺参数进行优化，确定承载量133 g·L-1，样品质量浓度为8 g·L-1，流动相为15%乙醇，流速为1 mL·min-1时纯化效果最佳，3′甲氧基葛根素能够与葛根素最大限度的分离，葛根素≥95%以上的回收率达到9735%。整个分离纯化工艺体无复杂溶剂体系，所用溶剂毒性低，分离纯化设备简单，易于产业转化。

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[责任编辑孔晶晶]