糖尿病大鼠骨折愈合过程中VEGF、BMP-2及BMP-7的动态观察

唐周舟　许永涛　马亮

434020　湖北省荆州市中心医院骨科



·论著·

糖尿病大鼠骨折愈合过程中VEGF、BMP-2及BMP-7的动态观察

唐周舟许永涛马亮

434020湖北省荆州市中心医院骨科

【摘要】目的动态观察糖尿病模型大鼠骨折愈合过程中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的变化趋势，探索影响糖尿病骨折愈合的机制。方法选取Wester 雄性大鼠70只，采用随机数字表法分为糖尿病组[(腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造模]和对照组，每组35只。采用线锯锯断2组大鼠的左侧胫骨，采用外固定复位处理，观察2组大鼠术后第1、3、5、7周的血清及骨痂中VEGF、BMP-2、BMP-7的表达变化。结果糖尿病组大鼠术后第1周、术后第3周的VEGF、BMP-2、BMP-7的表达水平均显著低于对照组(P<0.05)，术后第5、第7周2组大鼠骨痂组织中的VEGF、BMP-2、BMP-7的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组与对照组大鼠的血清中VEGF、BMP-2、BMP-7在术后第1～7周差异无统计学意义(P>0.05)，糖尿病大鼠术后第1、第3周BMP-7的表达水平显著低于对照组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论糖尿病大鼠血清、骨痂组织中BMP-7、BMP-2及VEGF表达减少可能是其延迟愈合的一个重要原因。

【关键词】糖尿病；骨折；血管内皮细胞生长因子；骨形态发生蛋白-2；骨形态发生蛋白-7

糖尿病是体内血糖代谢异常导致的内分泌失衡性疾病，相关研究表明，该病不仅是内分泌系统疾病，炎性因子以及免疫调节因子在其发生发展中同样重要的作用[1]。骨折患者采用外固定或者切口内固定治疗后，骨折部位愈合往往可以自行愈合，但局部血流供应、相关炎症损伤以及自身免疫性因素均在一定程度上影响了骨折部分骨痂线的形成[1,2]。糖尿病患者体内血糖代谢失衡，动脉血中的异常升高的血糖将导致骨折延迟愈合，或者不愈合[3]。随着细胞生物学以及分子生物学的发展，影响骨折代谢的细胞因子在骨折愈合中的作用研究愈加受到重视。本研究动态观察糖尿病模型大鼠骨折愈合过程中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、BMP-7的变化趋势，探索影响糖尿病骨折愈合的机制。

1材料与方法

1.1实验动物选取Wester 雄性大鼠70只，编号后采用随机数字表法分为糖尿病组[腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造模]和对照组，每组35只。体重230～280 g，平均体重(264±12)g；均喂养于光照12 h、自由进食进水、湿度40%～60%、温度23～25℃的环境中，所有实验大鼠均购买自吉林大学医学中心(动物实验研究中心，动物许可证号：SCXK2014-0081)。

1.2造模方法无特定病原体动物级2个月龄雄性大鼠70只(江苏省动物实验中心提供),体重250～300 g。糖尿病组:于实验前禁食24 h,实验时以4%水合氯醛280 μl/kg腹腔注射麻醉,固定于无菌手术板上,给予50 mg/kg STZ腹腔内一次性快速注射。动物单笼喂养,定量饮水与普通喂食饲养14 d。糖尿病组大鼠模型在诱导剂注射前和诱导剂注射后14 d。若诱导剂注射前基础血糖水平<8.0 mmol/L,诱导后14 d血糖水平>11.1 mmol/L,大鼠体重明显下降,且随机抽样的胰腺组织学观察证实胰岛细胞被破坏,即可视为糖尿病模型诱导成功。

1.3检测方法摄左下肢X线片,门静脉采血5 ml,3 000 r/min离心15 min,取上清液冷冻保存待测;处死大鼠后,取骨折断端及周围组织,以0.9%氯化钠溶液冲洗,10%甲醛固定12～24 h备用。全部标本采集完成后一次性成批检测VEGF、BMP-2、BMP-7。骨组织中相关指标的检测：骨折断端组织于10%甲醛溶液固定12～24 h后,经10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙3周,脱钙满意后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚5 μm,HE染色后经病理学检查确认。

2结果

2.12组大鼠骨痂组织中VEGF、BMP-2、BMP-7的表达灰度值变化2组大鼠的骨痂组织中VEGF、BMP-2、BMP-7在术后第1～3周呈现降低趋势，之后逐渐恢复；糖尿病组大鼠术后第1周、第3周均显著低于对照组(P<0.05或<0.01)；术后第5周、第7周2组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.22组大鼠骨血清中VEGF、BMP-2、BMP-7的表达水平变化2组大鼠血清中VEGF、BMP-2、BMP-7在术后第1～7周呈先增高后降低，在术后第5～7周差异无统计学意义(P>0.05)；糖尿病组大鼠术后第1、第3周BMP-7的表达水平显著的低于对照组(P<0.05或<0.01)。见表2。

2.32组大鼠X线片观察术后第1周2组X线片下骨痂形成数量较少，骨痂形成阴影差距不明显；术后第3、5周，2组骨折侧胫骨骨折部位的骨痂形成数量增加，但糖尿病组的骨痂形成透光阴影疏密不均，其光密度明显低于对照组；术后第7周，对照组骨折已经基本愈合，骨折线消失，糖尿病组的骨折断端仍然存在骨痂稀疏不均匀，骨折线存在。见图1～4。

表12组大鼠骨痂组织中VEGF、BMP-2、BMP-7的表达灰度值

指标术后第1周术后第3周术后第5周术后第7周VEGF 对照组163.4±7.2146.4±8.0158.6±6.1175.0±8.9 糖尿病组157.1±8.9140.1±6.9155.2±7.3174.8±8.5 t值2.9542.7611.2090.894 P值<0.05<0.05>0.05>0.05BMP-2 对照组154.6±5.5139.4±6.2155.5±7.2168.9±9.1 糖尿病组143.7±6.1130.5±7.4156.3±8.1167.2±8.8 t值3.0293.1160.4180.397 P值<0.05<0.05>0.05>0.05BMP-7 对照组181.4±8.3170.2±7.7182.0±7.9189.9±8.5 糖尿病组158.0±9.1144.3±6.1181.5±8.3187.8±9.3 t值4.5925.0130.6040.775 P值<0.001<0.001>0.05>0.05

表22组大鼠骨血清中VEGF、BMP-2、BMP-7的表达水平变化

指标术后第1周术后第3周术后第5周术后第7周VEGF 糖尿病组1.77±0.092.98±0.142.31±0.081.72±0.09 对照组1.79±0.123.04±0.122.32±0.091.69±0.10 t值0.5070.6180.4920.528 P值>0.05>0.05>0.05>0.05BMP-2 糖尿病组2.20±0.072.70±0.122.31±0.092.15±0.07 对照组2.35±0.102.83±0.112.30±0.072.13±0.05 t值0.7290.6740.0840.105 P值>0.05>0.05>0.05>0.05BMP-7 糖尿病组1.57±0.382.04±0.411.96±0.331.40±0.27 对照组3.01±0.923.29±0.572.04±0.391.47±0.30 t值4.0963.1860.2630.379 P值<0.01<0.05>0.05>0.05

糖尿病组对照组

图1术后第1周X线片

糖尿病组对照组

图2术后第3周X线片

3讨论

在巨大外力作用下，出现了骨折移位线，骨皮质连续性中断，并可出现骨小梁的微小隐匿性骨折。对于骨折部位无明显肌腱断裂、神经或者血管损伤的患

糖尿病组对照组

图3术后第5周X线片

糖尿病组对照组

图4术后第7周X线片

者，可早期清创一期复位[4,5]，而对于创伤较大，切口呈开放性的骨折，需要彻底清除坏死的肌瓣及异物，促进伤口预后和骨折部位的固定。一般认为，影响骨折愈合的因素包括全身因素及局部因素如骨折的类型和数量、骨折部位的血液供应、软组织的损伤程度、软组织的嵌入、感染等[6,7]。其中在骨痂形成、塑形与改建期，骨折部位骨小梁的形成对于骨折愈合具有重要意义。原始骨痂形成期骨内、外膜增生，新生血管长入，成骨细胞大量增生，合成并分泌骨基质，而骨板形成塑形期可见原始骨痂中新生骨小梁增粗，排列逐渐规则和致密[8]。VEGF是最有力的促血管生长因子,VEGF的表达受多种因素的调控,BMP能够诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化为成软骨细胞和成骨细胞,导致新骨形成[9,10]。本研究通过动态分析观察VEGF以及BMP的变化，进而揭示其在骨折愈合中的作用。

本研究观察到，2组骨折大鼠模型在术后第1周2组大鼠的X片下骨痂形成数量较少，且均无明显骨痂形成，在这一时期，2组均处于炎症期，主要表现为血管扩张、血浆渗出、水肿及炎性细胞浸润，并有少量新生血管以及软骨痂形成，但无明显骨痂线的形成。术后第3、5周，2组大鼠骨折侧胫骨骨折部位的骨痂形成数量增加，但可以观察到糖尿病组大鼠其骨痂数量较少，提示糖尿病可以影响软骨痂期或者硬骨痂期大鼠体内骨痂的形成或者软骨痂的塑形，导致术后7周仍然出现部分骨痂线未完全愈合，出现延迟愈合。自第2周,随着骨折的修复,肉芽组织长入血肿,软骨细胞及成骨细胞侵入发生软骨内骨化及膜内骨化，而VEGF、BMP-2、BMP-7在这一时期内呈现逐渐上升的趋势，提示了VEGF对于新生血管的调控作用。骨形成蛋白诱导间质细胞分化为软骨或者骨细胞对于软骨的形成、骨化及内膜骨化具有明显的一致性，提示了VEGF、BMP-2、BMP-7在术后4周内显著促进骨折愈合。而术后4周内3个指标明显较对照组低,提示在愈合关键时期,这些促骨骼生长因子的减少是糖尿病骨折延迟愈合的重要原因。这对这一发现，临床上可以对于糖尿病患者进行体外VEGF、BMP-2、BMP-7的诱导注射治疗，通过特异性地合成诱导成熟富集，定向注射到骨折部位，进而有利于促进骨折愈合[11,12]。然而术后5～7周的骨折大鼠，其体内血清以及骨组织中VEGF、BMP-2、BMP-7的表达无明显差异，考虑糖尿病组大鼠体内的低水平可以反馈性调节机体分泌相关骨折影响因子，但这一时期的骨诱导分化蛋白及血管形成调控因子的表达对于相关分化较为成熟的软骨或者骨内膜等组织的影响较小，难以发挥促进骨折愈合的作用。

综上所述，糖尿病大鼠血清、骨痂组织中BMP-7、BMP-2及VEGF表达减少可能是其延迟愈合的一个重要原因，但各因素、各细胞因子之间的相互作用和影响的机制不清楚，需要进一步研究。

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Dynamic observation on the changes of BMP-7,BMP-2 and VEGF during fracture healing in diabetic rat models

TANGZhouzhou,XUYongtao,MALiang.

CentralHospitalofJingzhouCity,Hubei,Jingzhou434020,China

【Abstract】ObjectiveTo observe dynamically the changes of vascular endothelial growth factor (VEGF), bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) during fracture healing in diabetic rats,and to explore the mechanism of affecting fracture healing in diabetic rats.Methods Seventy Wistar male rats were selected in the study,according to random digits table these rats were divided into diabetes group (n=35) in which the rats were injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ) to establish diabetes models, and the other 35 rats were served as control group. The left tibias of rats in both groups were sawn to break,then were treated by external fixation reduction.The changes of expression levels of VEGF,BMP-2,BMP-7 in serum and bony callus were detected and observed on 1w,3w,5w,7w after operation.ResultsThe expression levels of BMP-7,BMP-2 and VEGF in bony callus of diabetes group were significantly lower than those in control group on 1w,3w after operation (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression levels of VEGF,BMP-2,BMP-7 in bony callus on 5w,7w after operation between two groups (P>0.05). There were no significant differences in the serum levels of VEGF,BMP-7,BMP-7 from the first week to the seventh week after operation between two groups (P>0.05),except that the expression levels of BMP-7 in diabetes group on 1w,3w after operation were significantly lower than those in control group (P>0.05).ConclusionThe decrease of expression levels of BMP-7,BMP-2,VEGF in serum and bone callus of diabetic rats may be an important cause of delayed healing.

【Key words】diabetes mellitus;fracture;vascular endothelial growth factor;BMP-2;BMP-7

(收稿日期：2015-11-17)

【中图分类号】R 274.1

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)09-1297-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.004

项目来源：湖北省自然科学基金资助项目(编号:2015FFB05410)