高血压合并房颤患者外周血SIRT1表达及其与氧化应激的关系

欧阳春，张里克，卢远航，李先林

(湖北省中山医院，武汉430030)

高血压合并房颤患者外周血SIRT1表达及其与氧化应激的关系

欧阳春，张里克，卢远航，李先林

(湖北省中山医院，武汉430030)

目的 探讨高血压合并房颤患者外周血沉默信息调节因子1(SIRT1)mRNA和蛋白表达水平及其与氧化应激的关系。方法 选择高血压合并房颤患者60例，根据房颤类型分为持续房颤组26例和阵发房颤组34例，另选高血压窦性心律患者40例(对照组)，分别采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测各组外周血单核细胞SIRT1 mRNA和蛋白表达；采用硫代巴比妥酸法检测外周血丙二醛(MDA)，免疫比浊法检测外周血高敏C反应蛋白(hs-CRP)；分析外周血SIRT1表达与MDA、hs-CRP的关系。结果 阵发房颤组SIRT1 mRNA及蛋白表达显著高于持续房颤组、对照组(P均<0.05)，而持续房颤组、对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。持续房颤组血清MDA、hs-CRP水平均显著高于阵发房颤组和对照组(P均<0.05)；阵发性房颤组血清MDA、hs-CRP水平较对照组虽有升高趋势，但两组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。持续房颤组和阵发房颤组SIRT1表达与MDA呈负相关(P均<0.05)，与hs-CRP无明显相关性(P均>0.05)，对照组SIRT1表达与MDA、hs-CRP均无明显相关性(P均>0.05)。结论 SIRT1是心肌细胞的保护因素，与氧化应激呈负相关关系。

高血压；房颤；氧化应激；沉默信息调节因子1；丙二醛；高敏C反应蛋白

心房颤动(简称房颤)是临床常见的心律失常之一，有研究发现，氧化应激反应所产生的活性氧簇在促进房颤的发生中具有重要作用[1，2]。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶，可通过调节心脏活性氧簇，参与对氧化应激的调控[3，4]。因此推测，外周血SIRT1表达变化可能影响房颤的发生、发展过程，但目前鲜见关于SIRT1与房颤及氧化应激关系的报道。本研究观察高血压合并房颤患者外周血SIRT1表达变化，并分析SIRT1与氧化应激的关系，旨在为房颤的预防及治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年7月～2014年7月在我院住院治疗的高血压合并房颤患者60例。高血压的诊断参照《中国高血压防治指南》(2010年版)[5]；房颤的诊断标准：心电图显示P波消失，代之以大小不等、形状各异、间隔不等、不规则的细小f波，频率一般为350～600次/min，f波间无等电位线存在，其发作呈持续(持续时间6～12个月)或阵发性(每次发作时间≤48 h，服用药物后消失或自行消失)。排除标准：①合并冠心病、风湿性心脏病者；②合并严重感染或伴有自身免疫性疾病者；③肝肾功能异常或合并呼吸系统疾病者；④罹患糖尿病、继发性高血压或恶性肿瘤者。根据房颤类型分为持续房颤组26例、阵发房颤组34例。持续房颤组男11例、女15例，年龄(56.8±6.3)岁，合并高血脂23例；阵发房颤组男14例、女20例，年龄(57.6±7.5)岁，合并高血脂29例。同期另选在我院就诊的高血压窦性心律患者40例(对照组)，男16例、女24例，年龄(55.9±6.1)岁，合并高血脂33例。三组性别、年龄及合并高血脂情况等具有可比性。

1.2 相关指标观察

1.2.1 外周血SIRT1 mRNA ①总mRNA提取：抽取各组肘静脉血5 mL，置于抗凝管中，2 500 r/min离心10 min，分离单核细胞；抽取单核细胞，置于离心管中，加入5倍生理盐水摇匀，2 500 r/min离心15 min，弃去上清液；再加入1.5 mL TRIzol溶液，充分振荡使细胞完全裂解；分别加入100 μL氯仿、500 μL异丙醇摇匀，静置10 min，2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀用吸水纸吸干，室温干燥5 min。将提取的总RNA加入1 μL溴酚蓝，置于琼脂糖凝胶上样孔内，常规电泳20 min，以紫外分光光度计检测总RNA光密度(OD)，OD260/OD280为1.8～2.0为合格。②cDNA合成：采用SYBR Green Assay逆转录反应体系。将提取的总mRNA按照以下条件逆转录为cDNA：总RNA 2 μL，2×buffer 10 μL，Oligo(DT) 0.5 μL，dNTP 10 mmol，逆转录酶22 U/μL，DMSO 44 μL，RNasin 0.25 μL，ddH2O 0.25 μL。上述体系放入PCR扩增仪中反转录。反应条件：60 ℃变性5 min，30 ℃变性1 min，60 ℃退火20 min，95 ℃延伸10 min，最后10 ℃延伸5 min。③SIRT1 mRNA表达检测：采用实时荧光定量PCR法。引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司设计，SIRT1上游引物：5′-ATGTAGAGTCTGATGGTCTAGC-3′，下游引物：5′-CGTTGTGGTGTTAGTTTCTGCG-3′；内参GAPDH上游引物：5′-CACGATCATCATCTCTCAGCTT-3′，下游引物：5′-AAGTCGTTCGGATGGCTGTACA-3′；PCR反应体系20 μL：Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环后72 ℃延伸5 min。根据扩增曲线与溶解曲线计算Ct值，目的基因相对表达量=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct；ΔΔCt=试验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.2.2 外周血SIRT1蛋白 采用Western blotting法。将外周血用裂解液处理后，按照Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白含量；凝胶蛋白电泳，将电泳凝胶用NC膜转膜后封闭，再置于封闭液稀释的Ⅰ抗孵育，化学发光显影后扫描，White/Ultraviolet Transilluminator凝胶成像分析系统进行分析半定量。以β-actin作为内参照，二者比值为相对表达量。

1.2.3 氧化应激指标 清晨空腹抽取各组肘静脉血2 mL，静置1 h，2 500 r/min分离15 min，取血清，保存备检。采用硫代巴比妥酸法检测血清丙二醛(MDA)、采用免疫比浊法检测血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)。

2 结果

2.1 各组外周血SIRT1 mRNA及蛋白表达比较 见表1。

表1 各组外周血SIRT1 mRNA及蛋白相对表达比较

注：与持续房颤组比较，*P<0.05；与阵发房颤组比较，#P<0.05。

2.2 各组血清MDA、hs-CRP水平比较 见表2。

表2 各组血清MDA、hs-CRP水平比较

注：与持续房颤组比较，*P<0.05。

2.3 SIRT1 mRNA表达与MDA、hs-CRP的关系 相关性分析显示，持续房颤组、阵发房颤组SIRT1 mRNA表达与MDA均呈负相关(r分别为-0.589、-0.324，P均<0.05)，与hs-CRP均无明显相关性(r分别为0.171、0.198，P均>0.05)；对照组SIRT1 mRNA表达与MDA、hs-CRP均无明显相关性(r分别为0.203、0.257，P均>0.05)。

3 讨论

据统计，60岁以上人群房颤的发病率约为1%，其发病率随着年龄增长逐渐升高[6]。研究证实，高血压伴发房颤患者发生栓塞性并发症的风险明显增加。房颤发生时心房肌的氧化应激产物增加、氧化还原基因表达失衡以及线粒体DNA存在氧化损伤，表明氧化应激与房颤的发生有关；氧化应激反应会损伤线粒体和钙泵功能，导致细胞内钙超载，进而激活依赖钙离子蛋白水解酶，促使心肌收缩功能减退，继而导致心房结构重构[7]。因此，对高血压患者给予抗氧化作用药物，可防止心房结构重构，减少房颤的发生。

SIRT是存在于多种生物中的高度保守基因，在人类共有7个同源基因，目前研究较多的是SIRT1。SIRT1在多种疾病中参与氧化应激反应的调控[8]。樊磊等[9]研究发现，SIRT1与先天性心脏病、心肌炎、心力衰竭等心脏疾病密切相关；SIRT1主要参与调节心肌细胞的生长、分化过程，对心脏的发育具有促进和保护作用[10]。Ulas等[11]在动物研究中发现，激活SIRT1能够促进内皮细胞NO合酶的活性，改善内皮功能，进而抑制动脉粥样硬化。赵军等[12]通过建立心室快速起搏所致心力衰竭犬模型发现，心肌SIRT1表达水平显著升高，提示SIRT1能够避免心肌细胞发生凋亡，证实SIRT1能够抑制心脏组织重构所致的心力衰竭。氧化应激反应参与了房颤的发生，其机制可能是氧化应激导致心房组织发生结构和电生理重构。谭含璇等[13]对心房快速起搏房颤犬给予抗氧化剂后，房颤发生率明显降低，房颤持续时间明显缩短，证实活性氧清除剂能够抑制心房发生电生理重构。胡明珠等[14]报道，SIRT1表达上调能够激活FOXO信号途径，导致机体氧化应激水平显著降低，从而避免机体发生氧化应激损伤。邬云斌等[15]也证实，SIRT1能够通过抑制氧化应激水平，阻断p53诱导的细胞凋亡；当机体发生氧化应激反应时，SIRT1能够使p53去乙酰化，调节细胞的代谢；而能量限制会进一步诱导SIRT1表达增加，使细胞氧化应激损伤减轻。推测SIRT1可能参与了房颤的发生。

本研究结果显示，阵发房颤组SIRT1表达水平显著升高，提示在房颤早期SIRT1高表达能够抑制房颤的发展，但随着阵发性房颤发展成持续性房颤，SIRT1表达开始降低。本研究还发现，持续房颤组血清MDA、hs-CRP水平显著高于对照组、阵发房颤组，而阵发房颤组与对照组比较，血清MDA、hs-CRP水平也有升高趋势，提示炎症对房颤的促发和维持可能有一定作用。相关分析显示，无论持续还是阵发房颤，SIRT1 mRNA表达与MDA均呈负相关，而对照组SIRT1 mRNA表达与MDA、hs-CRP无明显相关性，与孙雪林[16]等报道一致。当炎症因子沉积于心房组织中，会导致局部组织发生纤维化，进而诱发房颤；炎症与氧化应激互为因果，共同导致心房结构和功能发生重构[17，18]。房颤患者SIRT1表达与MDA呈负相关，说明SIRT1能够抑制氧化应激，特别对于阵发房颤。SIRT1能够在早期抑制房颤的发展。但随着房颤程度的加重，这种保护作用开始减弱[19，20]。

综上所述，高血压合并房颤患者外周血SIRT1表达增加，SIRT1与氧化应激呈负相关，与hs-CRP无明显相关性，故认为SIRT1是心肌细胞的保护因素，通过降低氧化应激反应可抑制房颤的进展。但本研究未充分考虑持续SIRT1表达对心肌细胞和房颤的不利影响，确切结论还有待于进一步研究证实。

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