喉癌组织糖原合成酶激酶3β、T细胞因子4表达及意义

魏金龙，刘鸣，王苏亮，赵治明，杨艳，李晶，袁雪

(1哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150001；2齐齐哈尔医学院附属第二医院)

喉癌组织糖原合成酶激酶3β、T细胞因子4表达及意义

魏金龙1,2，刘鸣1，王苏亮2，赵治明2，杨艳2，李晶2，袁雪2

(1哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150001；2齐齐哈尔医学院附属第二医院)

目的 探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和T细胞因子4(TCF-4)在喉癌发生、发展中的作用。方法 采用免疫组织化学法检测45例喉癌患者喉癌组织(观察组)及其癌旁正常组织(对照组)GSK-3β和TCF-4的表达情况，分析喉癌组织GSK-3β、TCF-4阳性表达与患者临床病理参数的关系，探讨喉癌组织GSK-3β与TCF-4表达的关系。结果 观察组与对照组GSK-3β阳性表达率分别为86.67%、22.22%， TCF-4阳性表达率分别为80.00%、15.56%；两组比较P均<0.05。TCF-4、GSK-3β阳性表达均与喉癌组织分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄和肿瘤分型均无关(P均>0.05)。GSK-3β和TCF-4表达无相关性(r=0.292，P>0.05)。结论 喉癌组织GSK-3β、TCF-4高表达可促进喉癌的发生、发展。

喉癌；糖原合成酶激酶3β；T细胞因子4；Wnt信号传导通路

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐年升高[1]，但其发病机制尚未明确。研究发现，Wnt信号通路的信号表达异常与多种肿瘤的发生、发展关系密切[2,3]。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和T细胞因子4(TCF-4)是Wnt信号通路中重要的信号分子。非小细胞肺癌组织中GSK-3β表达显著下降，影响β-链蛋白(β-catenin)的磷酸化降解过程[4]，导致过量的β-catenin进入细胞核，与核内TCF-4特异性结合，激活Wnt靶基因启动子的转录过程，促进肿瘤的发生、发展。本研究观察喉癌组织中GSK-3β和TCF-4的表达情况，探讨Wnt信号通路在喉癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2015年12月齐齐哈尔医学院附属第二医院诊治的喉癌患者45例，男36例、女9例，年龄29～75(55.8±11.7)岁，均为鳞状细胞癌，其中声门型22例、声门上型19例、声门下型4例；根据美国癌症联合委员会(AJCC)2002年制定的喉癌TNM分期标准，Ⅰ期6例、Ⅱ期20例、Ⅲ期16例、Ⅳ期3例。均经手术治疗，术中取病理组织明确诊断；术中分别取喉癌组织0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm作为观察组，取距肿瘤边缘≥3 cm处同样大小正常黏膜组织作为对照组。纳入标准：原发性喉癌；首次确诊为喉癌，术前未接受放疗、化疗、生物治疗等；临床资料完整。排除标准：合并内分泌疾病；确诊前曾使用雌激素或抗雌激素药物；合并其他原发性肿瘤。本研究通过我院伦理委员会批准，研究对象对本研究均知情同意。

1.2 GSK-3β、TCF-4表达检测 将两组标本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成厚度为3～5 μm厚的切片，于60 ℃环境中烘烤12 h；脱蜡，入水；0.1 mol/L PBS冲洗，滴加山羊血清，室温下封闭20 min；滴加兔抗人TCF-4单克隆抗体(1∶150)、兔抗人GSK-3β单克隆抗体(1∶100)于4 ℃培养12 h；PBS冲洗后滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃培养20 min；用PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，DAB试剂盒显色，苏木素复染，封片。实验步骤均严格按照试剂盒说明书进行。GSK-3β阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色；TCF-4阳性表达定位于细胞质和细胞核，呈棕黄色。400倍镜下随机选取5个互不重叠的视野，计数视野内细胞数及阳性细胞数。阳性细胞百分比评分：<5%为0分，≥5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～80%为3分，>80%为4分；细胞染色程度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。两项评分相乘为0～4分为阴性，5～7分为弱阳性，8～12分为强阳性。弱阳性、强阳性均记为阳性。分析喉癌组织GSK-3β、TCF-4阳性表达与患者临床病理参数的关系。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSK-3β、TCF-4表达 观察组GSK-3β表达阴性6例、弱阳性24例、强阳性15例，阳性表达率为86.67%；对照组分别为36、9、1例及22.22%；观察组阳性表达率高于对照组(P<0.05)。观察组TCF-4表达阴性9例、弱阳性17例、强阳性19例，阳性表达率为80.00%；对照组分别为38、6、1例及15.56%；观察组阳性表达率高于对照组(P<0.05)。见插页Ⅲ图6。

2.2 喉癌组织TCF-4、GSK-3β阳性表达与患者临床病理参数的关系 喉癌组织TCF-4、GSK-3β阳性表达与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移均有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄和肿瘤分型均无关(P均>0.05)。见表1。

表1 喉癌组织TCF-4、GSK-3β表达与患者临床病理参数的关系(例)

2.3 喉癌组织中GSK-3β与TCF-4阳性表达的关系 喉癌组织中GSK-3β和TCF-4阳性表达无相关性(r=0.292，P>0.05)。

3 讨论

导致喉癌发生的因素有很多，如吸烟、空气污染等环境因素及信号通路异常等分子生物学因素等[5]。Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号通路传导异常与多种肿瘤的发生均关系密切。李冬等[6]利用香烟烟雾对肺癌小鼠模型进行刺激，发现小鼠肺癌组织中TNF-α和β-catenin表达显著升高，继而通过Akt/GSK-3β途径激活Wnt/β-catenin信号通路。Wnt信号通路通过Wnt蛋白与细胞表面的Frizzled受体结合，导致细胞质中的Dishevelled蛋白接受上游信号，抑制细胞质中腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、轴蛋白(Axin)和GSK-3β之间形成复合物，从而避免细胞质内β-catenin被大量降解，导致多余的β-catenin进入细胞核，与其内的TCF-4结合，启动下游靶基因的转录[7]；此通路上任何一个位点发生变异，均可能导致肿瘤的发生。

本研究发现，喉癌组织GSK-3β、TCF-4阳性表达率均显著高于癌旁正常黏膜组织，TCF-4、GSK-3β阳性表达均与喉癌分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，与Li等[8]研究结果相似，提示Wnt信号通路异常参与喉癌的发生、发展。原因可能为喉癌细胞内APC基因发生突变，导致体内合成的APC蛋白不具有与β-catenin、GSK-3β形成复合物的能力[9，10]。GSK-3β作为Wnt通路中重要的的负性调节因素，可以将β-catenin中的丝氨酸和苏氨酸位点磷酸化，使β-catenin大量降解，从而沉默Wnt通路[11，12]。GSK-3β亦可使APC发生磷酸化，降解β-catenin，沉默Wnt通路[13,14]。当存在Wnt信号刺激时，喉癌细胞质内大量β-catenin蓄积，并与核内的TCF-4结合，形成的复合体激活Wnt靶基因，促使其发生转录，促进肿瘤细胞的增殖。结合上述研究结果，推测虽然喉癌组织GSK-3β蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常黏膜组织，但绝大部分处于失活状态，无法在细胞质内形成APC-GSK-3β-Axin复合体，无法降解细胞质中的β-catenin，故仍然有大量β-catenin进入细胞核，进而激活TCF-4/LEF-1通路，启动喉癌靶基因，促进癌症的发生。本研究喉癌组织中GSK-3β和TCF-4表达无相关性，也间接支持上述推论。Wang等[15]认为，细胞质中GSK-3β被磷酸化可导致其失活；Cuilliere-Dartigues等[16]则认为，喉癌发生过程中可能存在其他通路导致TCF-4水平异常升高；但GSK-3β失活的确切机制有待进一步研究。

综上所述，喉癌组织GSK-3β、TCF-4阳性表达显著升高，二者高表达导致Wnt信号传导通路异常，进而促进喉癌的发生、发展，但其具体作用机制有待进一步研究。

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齐齐哈尔市科学技术研究与发展计划项目(SFGG201446)；哈尔滨医科大学附属第二医院科研项目。

刘鸣(E-mail： 244544098@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.021

R739.6

B

1002-266X(2016)28-0060-03

2016-01-22)