多西他赛联合BEZ235对Kras基因突变的肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制

2016-05-10 11:24程留奇张中冕王海莉庄琰李静
山东医药 2016年28期
关键词:多西单药基因突变

程留奇,张中冕,王海莉,庄琰,李静

(郑州大学第二附属医院,郑州450000)

多西他赛联合BEZ235对Kras基因突变的肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制

程留奇,张中冕,王海莉,庄琰,李静

(郑州大学第二附属医院,郑州450000)

目的 观察多西他赛联合BEZ235不同作用方式对Kras基因突变的A549细胞凋亡的影响,探讨其作用机制。方法 体外培养Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞,采用不同浓度多西他赛(2.5、5、10、20、40 μg/L)和BEZ235(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)干预24、48、72 h;MTT法检测细胞增殖抑制率,确定BEZ235的最佳干预浓度为17.5 μmol/L、多西他赛的最佳干预浓度为15.3 μg/L,二者最佳干预时间均为48 h。另取人肺腺癌A549细胞,随机分为对照组(耐药组)、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组(两药同时应用)、多西他赛序贯BEZ235组(给予多西他赛24 h改用BEZ235 24 h)、BEZ235序贯多西他赛组(给予BEZ235 24 h改用多西他赛24 h),均给予最佳干预时间及最佳干预浓度,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测pAKT、pERK蛋白表达。结果 对照组、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组、多西他赛序贯BEZ235组、BEZ235序贯多西他赛组A549细胞凋亡率逐渐升高(P均<0.05),pAKT蛋白相对表达量逐渐降低(P均<0.05)。BEZ235单药组pERK蛋白相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),但均高于其他各组(P均<0.05)。结论 多西他赛和BEZ235不同联合作用方式作用下均可促进Kras基因突变的A549细胞凋亡,以BEZ235序贯多西他赛效果最好;降低pAKT及pERK表达,协同抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路可能是其作用机制。

肺癌;多西他赛;BEZ235;Kras基因; A549细胞

肺腺癌是肺癌的主要类型[1],约20%的肺腺癌患者出现Kras基因突变[2],这部分患者对多数靶向治疗药物不敏感[3]。Kras基因是ras基因家族的主要成员,人肿瘤细胞中Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT/mTOR通路是ras信号传导通路下游的两条重要通路。多西他赛是目前肺腺癌的一线化疗药物,通过抑制细胞有丝分裂而发挥抗肿瘤作用。BEZ235是阻断PI3K和mTOR的双重靶向抑制剂。多西他赛可增强BEZ235对前列腺癌细胞的敏感性[4],提示多西他赛可能对Raf/MEK/ERK通路有一定的抑制作用。2013年11月~2014年3月,本研究观察了多西他赛联合BEZ235不同作用方式对Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞株,由郑州大学第二附属医院实验室提供。BEZ235,购自上海翊圣生物科技有限公司;多西他赛,购自齐鲁制药有限公司。小鼠抗人p-AKT抗体、p-ERK抗体购自美国Santa Cruz公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,购自南京诺唯赞生物科技有限公司;LAS4000型荧光图像分析仪,购自日本FUJIFILM公司。

1.2 细胞培养 取Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞,置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基,37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长,隔天传代1次,取对数生长期细胞用于实验。

1.3 多西他赛、BEZ235最佳浓度确定 取对数生长期A549细胞,调整细胞密度为5×104/mL,接种于96孔板,每孔200 μL,常规培养24 h;向96孔板加入药物,多西他赛浓度设置为2.5、5、10、20、40 μg/L,BEZ235浓度设置为1.25、2.5、5、10、20 μmol/L。另设一个空白孔和一个对照孔,分别加入等量的RPMI 1640培养基。分别于药物干预24、48、72 h时采用MTT法检测细胞增殖抑制率,确定多西他赛最佳干预时间及最佳干预浓度。结果显示,两药最佳干预时间均为48 h,多西他赛最佳干预浓度为15 μg/L、BEZ235为17.5 μmol/L。

1.4 细胞凋亡检测 取对数生长期A549细胞,调整细胞密度至5×104/mL,接种于96孔板,每孔200 μL,待细胞贴壁后,分为对照组(不加药物)、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组(两药同时应用)、多西他赛序贯BEZ235组(给予多西他赛24 h改用BEZ235 24 h)、BEZ235序贯多西他赛组(给予BEZ235 24 h改用多西他赛24 h)。各组均采用1.3确定的最佳干预时间及干预浓度。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次,取平均值。

1.5 pAKT、pERK蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期A549细胞,调整细胞密度至5×104/mL,接种于96孔板,每孔200 μL。实验分组及处理同1.4。各组培养48 h,采用RIPA蛋白裂解液收集各组细胞总蛋白,分别进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭,分别加入1∶1 000稀释的pAKT、pERK单克隆抗体及山羊抗鼠IgG杂交液(1∶5 000)。采用Image Quant LAS4000软件扫描各组对应条带的灰度值,计算pAKT、pERK蛋白相对表达量。

2 结果

对照组、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组、多西他赛序贯BEZ235组、BEZ235序贯多西他赛组A549细胞凋亡率逐渐升高,pAKT蛋白相对表达量逐渐降低,各组间比较P均<0.05。BEZ235单药组ERK蛋白相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05),但均高于其他各组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞凋亡率及pAKT、pERK蛋白相对表达量比较

注:与对照组比较,*P<0.05;与多西他赛单药组比较,#P<0.05;与BEZ235单药组比较,△P<0.05;与BEZ235同步多西他赛组比较,▲P<0.05;与多西他赛序贯BEZ235组比较,▽P<0.05。

3 讨论

有研究证实,发生Kras基因突变的肺癌患者极少发生表皮生长因子受体(EGFR)突变或间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因重组,因此应用靶向药物治疗效果欠佳[6,7]。BEZ235是PI3K/mTOR双靶点抑制剂,本课题组前期研究证实,BEZ235可抑制A549细胞AKT mRNA表达,但对Raf/MEK/MAPK通路并无明显影响[8]。BEZ235单独用于Kras基因突变的肺癌小鼠时效果欠佳,联合MEK抑制剂效果较好。对于存在MEK抑制剂抵抗的肺癌及直肠癌细胞株,BEZ235联合MEK抑制剂显示出更好的疗效。因此认为,Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT/mTOR通路之间可能存在交互作用,PI3K级联和Raf级联在肺腺癌的进展中发挥关键作用[9,10],即使在PI3K级联信号传导受阻时,细胞仍可以通过Raf级联调节肿瘤细胞的生物学特性[11]。Yasumizu等[4]针对前列腺癌细胞的研究显示,多西他赛可增强BEZ235的抗肿瘤作用,多西他赛可能同时对Raf/MEK/ERK通路及PI3K/AKT/mTOR通路有抑制作用。

本研究结果显示,BEZ235及多西他赛均能促进A549细胞凋亡,两药联合应用促凋亡效果更明显,且BEZ235序贯多西他赛组细胞凋亡率最高。AKT、ERK是PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路的关键因子,pAKT及pERK是二者的磷酸化(活化)形式。Western blotting结果显示,相对于对照组,BEZ235可降低pAKT表达、对pERK表达并无影响,而多西他赛可同时降低pAKT及pERK表达,两药联合相对于单药可进一步降低pAKT及pERK表达;提示多西他赛能同时抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路;BEZ235序贯多西他赛显示出更好的抑制效果,原因可能为BEZ235可克服存在Kras基因突变的肺腺癌细胞对多西他赛治疗的抵抗,提示BEZ235与多西他赛在抑制Kras基因下游信号传导过程中具有协同作用。

综上所述,多西他赛和BEZ235不同联合作用方式下均可促进Kras基因突变的A549细胞凋亡,以BEZ235序贯多西他赛效果最好;降低pAKT及pERK表达,协同抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路可能是上述结果产生的原因。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.012

R734.2

A

1002-266X(2016)28-0037-03

2015-10-26)

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