海红果酒多糖的结构鉴定及降血糖活性验证

花俊丽， 杨 辉， 杜 丁， 冯丽琴

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)



海红果酒多糖的结构鉴定及降血糖活性验证

花俊丽， 杨 辉， 杜 丁， 冯丽琴

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

海红果酒经过浓缩、超滤、醇沉，离心得到海红果酒粗多糖，依次用AB-8大孔树脂吸附法、流水透析法和Sephadex-20葡聚糖凝胶层析法对粗多糖进一步纯化得到精制多糖，并对其结构进行了初步研究，同时还验证了海红果酒多糖的降血糖活性.结果表明：海红果酒多糖的相对分子质量为3.3×105Da，由鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸5种单糖组成；经红外检测证实具有多糖的特征吸收峰；海红果酒多糖具有一定的降血糖活性，且精制多糖的降血糖活性优于粗多糖.

海红果酒； 多糖； 分离纯化； 结构分析 ；降血糖活性

0 引言

多糖，是一类由大量单糖通过有支链或无支链的糖苷键链接起来的碳水化合物[1]，具有贮存能量、结构支撑、抗氧化、抗炎，抗癌等生物效能[2].近年来，植物多糖的调节免疫功能、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等功效也越来越受到人们的重视.

海红果是我国稀有的果树资源，果实成熟后为鲜红色，肉脆多汁，酸甜爽口，营养丰富，含人体必需氨基酸和多种矿物质元素.中药大辞典记载[3]：“海红，为蔷薇科苹果属西府海棠的果实；味酸、甘、平，无毒；功能主治：涩肠止痢，主治泄泻，痢疾”.常食能健胃消食，去腥除腻，解除疲劳，软化血管，醒脑提神，同时还具有通宣肺气、止咳化痰、和胃健脾，美容养颜等功效[4].此外，海红果是一种耐旱、抗寒、耐薄、病虫少，管理简便的高产水果，无论是在沙地、硬黄土、山坡，还是丘陵地带，海红果均能正常生长，所以在水土流失严重的贫困山区，仅靠天然降水，无需人工灌溉，海红果也可以获得高产，具有重要的生态和经济双重效益[5,6].

目前，对海红果的提取工艺[7-9]、化学成分[10,11]，以及药用价值[12-14]的研究取得了一定的成果，但对于海红果酒的研究报道却仅限于酿造工艺[15,16].本研究对海红果酒多糖的结构进行初步鉴定，并验证了其降血糖功能，以期为海红果酒的进一步研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验原料与仪器

1.1.1 主要原料

海红果酒,陕西省府谷县聚金邦农产品开发有限公司;AB-8树脂、Sephadex-2，Pharmacia公司；四氧嘧啶、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸，美国Sigma公司；盐酸苯乙双胍、 尿糖试纸，购于医药超市；三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、溴化钾，均为分析纯.

1.1.2 主要仪器

紫外分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；高效凝胶渗透色谱仪，美国Agilent公司；Beckman P/ACETM MDQ高效毛细管电泳仪，美国Beckman公司；FT-IR8400傅里叶变换红外光谱仪(配有DTGS/KBr检测器)，德国Bruker公司；BS-300全自动生化分析仪，深圳迈瑞公司.

1.2 试验动物

选择4周龄昆明种雄性小鼠(由第四军医大学动物研究中心提供)作为试验动物，体重25±2 g，在陕西中医学院标准动物房饲养，饲以第四军医大学试验动物中心提供的专用饲料.

1.3 实验方法

1.3.1 海红果酒多糖纯品的制备

海红果酒1 000 mL，经旋转蒸发浓缩至200 mL，采用超滤膜过滤除去蛋白质和核酸等生物大分子，采用透析袋透析48 h，浓缩，加入95%沉淀(乙醇浓度达到80%)，4 ℃静置48 h，离心分离.离心所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮和正丁醇分别洗涤3次，真空干燥至恒重，可得浅褐色多糖粗品.

将多糖粗品用去离子水重新溶解，过AB-8大孔树脂层析柱(2.6 cm×45.7 cm)，蒸馏水洗脱，浓缩洗脱液，流水透析48 h，再经过Sephadex-20葡聚糖凝胶柱(2.6 cm×45.7 cm)纯化，蒸馏水洗脱，真空冷冻即得无味洁白的粉末状海红果酒多糖纯品.

1.3.2 海红果酒多糖的相对分子质量的测定

海红果酒多糖的相对分子量采用高效凝胶渗透色谱仪法测定[17](HPGPC).HPGPC设备配有Agilent1100检测系统和G4000SW的凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm).流动相用0.5%的NaNO3，流速为0.6 mL/min.

1.3.3 海红果酒多糖的单糖组成

海红果酒多糖的单糖组成采用高效毛细管电泳确定[18].

(1)单糖标准品的α-萘胺衍生化

衍生试剂的配制：称取α-萘胺143.2 mg和NaBH3CN 35 mg，溶于450μL无水甲醇中，再加入41μL冰乙酸，置于冰箱中待用.

单糖的α-萘胺衍生：用超纯水配成浓度为20 mg/mL的各种单糖标准溶液，各取200μL，加入40μL衍生试剂置于安瓿管中封管，80 ℃恒温2 h衍生化.然后各加入三氯甲烷和重蒸水各1 mL，反复离心萃取3次，取上层水相过滤后，冷藏备用.

(2)海红果酒多糖水解样品的制备

取海红果酒精制多糖20 mg，加入1 mol/L H2SO41 mg，封管100 ℃恒温水解8 h，冷却后用碳酸钡完全中和，静置过夜，过滤取200μL，依照单糖的衍生方法衍生化.

(3)单糖及海红果酒多糖的测定

将衍生化的标准品及海红果酒精制多糖试液经孔径0.45μm的微滤膜过滤后，进行毛细管电泳，根据各吸收峰的峰面积计算单糖组成的相对比例.

1.3.4 海红果酒多糖的紫外光谱分析

称取海红果酒精制多糖1 mg，配制成0.1 mg/mL的溶液，以蒸馏水为对照，在190～700 nm范围内进行紫外光谱扫描，观察吸收峰.

1.3.5 海红果酒多糖的红外光谱分析

称取海红果酒精制多糖1 mg，与100 mg的KBr混匀研磨后压片，采用红外光谱仪扫描分析，波长范围为4 000～400 cm-1，初步确定多糖的结构.

1.3.6 海红果酒多糖降血糖活性的验证[19]

(1)空白对照小组

将小鼠严格禁食24 h，用尿糖试纸测尿糖，取尿糖呈阴性的小鼠20只作为正常小鼠对照组.

(2)高血糖小鼠模型的建立

将小鼠严格禁食24 h，尾静脉注射剂量为200 mg/kg mb的四氧嘧啶，72 h后，用尿糖试纸预测空腹尿糖，选取尿糖呈阳性+++的小鼠80只，随机分为4组，分别为阳性对照组，西药对照组、粗多糖对照组和纯多糖对照组，断尾取血用BS-300全自动生化分析仪测定血糖值.

(3)多糖降血糖试验

正常小鼠组：以0.2 mL/10 g mb的生理盐水灌胃；阳性对照组：以0.2 mL/10 g mb的生理盐水灌胃；西药对照组：以200 mg/kg mb的盐酸苯乙双胍水溶液灌胃；粗多糖对照组：以200 mg/kg mb的粗多糖水溶液灌胃；纯多糖对照组：以200 mg/kg mb的精制多糖水溶液灌胃.持续给药14 d，禁食12 h后，摘眼球取血，测血糖值.

2 结果与讨论

2.1 海红果酒多糖的相对分子质量的测定

从图1所示，海红果酒多糖在大约17 min时有一个吸收峰，表明海红果酒多糖是一种均质的多糖.海红果酒多糖的平均相对分子质量为3.3×105Da.

图1 海红果酒多糖的高效 凝胶渗透色谱图

2.2 海红果酒多糖的单糖组成分析

图2(a)为鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖醛酸标准品的高效毛细管电泳图。从图2(b)可看出，海红果酒多糖由鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸5种单糖组成.其中以葡萄糖和葡萄糖醛酸的含量较多，甘露糖的含量较少.根据峰面积计算出海红果酒多糖的组成比例为：Rha∶Man∶Glc∶Ara∶GluA=1.4∶1.0∶3.5∶2.2∶2.7.

(a)单糖标准品毛细管电泳图

(b)海红果酒多糖的毛细管电泳图图2 高效毛细管电泳图谱

2.3 海红果酒多糖的紫外光谱分析

由图3可知，在200 nm处海红果酒多糖有吸收峰，此处为多糖的特征吸收峰；在260～280 nm处没有出现吸收峰，表明不含核酸和蛋白质生物大分子.

图3 海红果酒多糖的紫外光谱图

2.4 海红果酒多糖红外光谱测定

如图4所示，红外光谱在3 410 cm-1处有吸收峰，说明有糖类存在的O-H伸缩振动；2 935 cm-1处的吸收峰表明，含有多糖类C-H2和C-H的非对称伸缩振动；1 743 cm-1和1 610 cm-1两处的吸收峰表明C=O和COO-[20]的非对称伸缩振动； 1 743 cm-1、1 610 cm-1和1 428 cm-1处的三个吸收峰表明了MWPS含有糖醛酸；1 428 cm-1和1 240 cm-1处的吸收峰也表明海红果酒多糖含有C-H键；此外，1 092 cm-1和1 022 cm-1处的吸收峰说明MWPS存在C-O-H键以及C-O-C糖苷键；400～905 cm-1处的吸收峰表明了海红果酒多糖具有吡喃糖环的骨架结构[21]；而在890～900 cm-1处的吸收峰则表明MWPS具有β-D-吡喃糖苷键(C1-H)的构型.

图4 海红果酒多糖的红外光谱图

2.5 海红果酒多糖的降血糖试验验证

注射四氧嘧啶成功建模的小鼠体重明显降低，较正常组小鼠消瘦，且被毛杂乱，毛色暗淡，出现多饮、多食、多尿以及掉毛现象.在灌胃初期，各试验小组的小鼠体重仍出现下降趋势，从给药第5天起，各试验小组与阳性对照组相比，摄食量、饮水量明显降低，小鼠的体重也趋于稳定，试验结束时，体重有所回升.其中纯多糖对照组小鼠的平均体重高于粗多糖对照组，精神状态也优于粗多糖组.测得各组小鼠的血糖值、体重和饮食量的对照数据见表1所示.

表1 各试验小组小鼠血糖值、体重和饮食量的对照

3 结论

海红果酒经浓缩、超滤、醇沉、AB-8大孔树脂吸附、流水透析及葡聚糖凝胶纯化可得到纯度较高的多糖；经过α-萘胺衍生化，利用高效毛细管电泳可测定海红果多糖的单糖组分，此方法简单易操作，且需要样品量少；经紫外光谱和FT-IR扫描，可初步断定海红果多糖具有典型的多糖特征；海红果酒多糖可以明显改善糖尿病小鼠多饮、多食，以及消瘦的症状，经过灌胃海红果多糖的糖尿病小鼠明显比阳性对照组的小鼠精神活跃，且精制海红果酒多糖的降血糖功能优于粗多糖.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Structure and hypoglycemic activity characterization of polysaccharide from Malus micromalus Makino wine

HUA Jun-li, YANG Hui， DU Ding, FENG Li-qin

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

A water-soluble polysaccharide from Malus micromalus Makino wine was obtained by successive purification using Macro porous resin AB-8 and Sephadex LH-20 gel-filtration chromatography.The structural characterization of the purified polysaccharide fraction was evaluated in this paper.The result showed that polysaccharide of Malus micromalus Makino wine was a homogeneous heteropolysaccharide including rhamnose, mannose,glucose,arabinose and glucuronic acid, with an average molecular weight of 3.3×105Da.Characterization of polysaccharide by FT-IR analysis showed the typical absorption of polysaccharide.And polysaccharide can significantly reduce blood glucose levels, and has potential use an anti-diabetic agent.

Malus micromalus Makino wine; polysaccharide; separation and purification; structural analysis; hypoglycemic activity

2016-03-16

陕西省科技厅科学技术研究发展计划项目(2014SJ-06-02)

花俊丽(1979-)，女，陕西华阴人，在读博士研究生，研究方向：生物大分子的分离提取

1000-5811(2016)05-0129-04

TS262.7

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